多肽信號(hào)對(duì)于細(xì)胞間交流具有重要作用,許多多肽作為激素參與了植物各種生長(zhǎng)發(fā)育過程以及環(huán)境響應(yīng)�？焖賶A化因子(RALF)就是植物多肽家族中的一類。RALF多肽激素參與了多種生理過程,比如:根系伸長(zhǎng)、植物-微生物互作以及花粉發(fā)育、授粉受精等。不同物種間RALF基因數(shù)量和功能多樣,而在番茄(Solanum lycopersicum)中RALF基因的功能尚不清楚。目前對(duì)于RALF多肽的研究主要集中在生長(zhǎng)發(fā)育方面,但在環(huán)境脅迫中的作用尚不清楚。本文鑒定了番茄中具有保守結(jié)構(gòu)的RALF基因,利用GUS報(bào)告基因研究其轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式,并利用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(VIGS)探究了 RALF在番茄生長(zhǎng)發(fā)育和低溫抗性中的功能。主要研究結(jié)果如下:1.鑒定了番茄的RALF基因,發(fā)現(xiàn)RALF4基因?qū)τ谡{(diào)控根系發(fā)育具有重要功能。利用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析番茄中SlRALR基因與擬南芥中AtRALF基因的同源性,并且根據(jù)RALF的保守結(jié)構(gòu)特點(diǎn)篩選出4個(gè)RALF基因。測(cè)定了它們?cè)诓煌鞴俳M織中的表達(dá)模式,推測(cè)RALF可能參與了不同器官的發(fā)育。RALF4主要在莖、葉、花中表達(dá),而在根中表達(dá)量遠(yuǎn)低于其他基因;RALF5主要在根和花中表達(dá),尤其以根中表達(dá)最為明顯;RALFR主要在根、莖、葉、花中表達(dá);RALF7主要在葉中表達(dá),而在根中表達(dá)量和RALF4一樣低。利用VIGS技術(shù)將RALR4、RALF5、RRAL6、RALF7基因沉默,研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照TRV植株相比,RALF4沉默植株生長(zhǎng)明顯矮化,而RALF5沉默植株生長(zhǎng)得到促進(jìn),RALF6、RALFR沉默植株則無(wú)明顯差異。結(jié)果表明,盡管RALF4、RALF5、RALF6同源性高,但是其功能出現(xiàn)分化。單獨(dú)將RALFR沉默植株與TRV植株比較,RALF4沉默植株的根系發(fā)育受到嚴(yán)重抑制,而RALFR在根系中表達(dá)量卻很低,表明RALF4可能在根系的特定發(fā)育階段發(fā)揮作用。以上結(jié)果表明,RALF5抑制植物生長(zhǎng),而RALF4對(duì)于根系的發(fā)育具有重要作用。2.明確了RALF4基因在根中的表達(dá)模式以及RALF4多肽并不通過影響生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)控側(cè)根發(fā)育。發(fā)現(xiàn)在低濃度RALF處理下,RALF4對(duì)于根伸長(zhǎng)的抑制作用不明顯,但是其仍具有RALF多肽處理幼苗提高培養(yǎng)基pH的生理活性。在轉(zhuǎn)基因植株pRALF4::GUS中,發(fā)現(xiàn)RALF4基因在根中的表達(dá)具有特異性,其主要在側(cè)根原基以及側(cè)根的基部表達(dá),表明RALF4可能并不參與主根的發(fā)育,而是影響側(cè)根的生長(zhǎng)。生長(zhǎng)素是根系發(fā)育最主要的激素,發(fā)現(xiàn)沉默RALF4導(dǎo)致根尖生長(zhǎng)素響應(yīng)增強(qiáng),生長(zhǎng)素合成增加。但外源處理RALF4之后,并沒有改變根中生長(zhǎng)素的響應(yīng)。同時(shí),對(duì)pRALF4::GUS外源處理NAA,發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素雖然能夠促進(jìn)側(cè)根發(fā)生但卻并不能誘導(dǎo)促進(jìn)RALF4的表達(dá)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了ralf4缺失突變體,進(jìn)一步明確了 RALF4在側(cè)根發(fā)育中的作用。因此,RALFR缺失導(dǎo)致根系發(fā)育受阻,其調(diào)控過程可能與生長(zhǎng)素信號(hào)相互獨(dú)立。基于RALFR GUS染色的情況,其可能在側(cè)根突破表皮的過程中發(fā)揮作用。3.明確了 RALF5對(duì)于低溫抗性的負(fù)調(diào)控作用。RALF4、RALF5、RALF6的表達(dá)量水平在低溫脅迫下先上調(diào)后下調(diào);利用VIGS技術(shù)沉默RALF4、RRAL5、RALF6三個(gè)基因,并對(duì)沉默植株進(jìn)行低溫處理,發(fā)現(xiàn)目的基因沉默植株抗性較對(duì)照TRV植株增強(qiáng),又以RALF5沉默植株的抗性最好。測(cè)定了沉默植株中CBF抗冷途徑中CBF1和COR47的基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)RALF5沉默植株的基因表達(dá)水平顯著上調(diào)且CBF1上調(diào)最多;同樣RALF5沉默植株ABA含量積累最多,并顯著高于對(duì)照TRV植株,并且這種積累與ABA合成基因NCED1表達(dá)水平的提高相關(guān);已有研究表明,BR信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子BZR1能夠調(diào)控CBf1/2基因,從而提高植物低溫抗性。RALF5沉默植株中,BR合成基因DET2也明顯上調(diào),表明BR也可能參與了低溫抗性的過程。以上實(shí)驗(yàn)表明RALF5負(fù)調(diào)控植物低溫抗性。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S641.2
【部分圖文】：

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑于發(fā)芽的番茄種子，會(huì)導(dǎo)致胚根的伸長(zhǎng)受到顯著停滯。在擬南芥中也觀察到類似逡逑現(xiàn)象。過表達(dá)兄不僅抑制主根的細(xì)胞伸長(zhǎng)，而且降低側(cè)根密度。兄４ＬＦ７基逡逑因敲除植株則在主根生長(zhǎng)和側(cè)根密度方面，表現(xiàn)出與過表達(dá)植株相反的表型。因逡逑此，ＲＡＬＦｓ多肽在根生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。逡逑（Ａ）邐（Ｂ）逡逑

邐）逡逑Ｃｅｌｌ邋ｅｔｏｎｇａｔｉｏｎ逡逑圖１．１邋ＲＡＬＦ參與的植物中生長(zhǎng)發(fā)育（Ｍｕｒｐｈｙ邋ｅｔａｌ，邋２０１４）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋ＲＡＬＦ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ａｎｄ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ邋（Ｍｕｑ？ｈｙ邋ｅｔ邋ａｌ，邋２０１４）逡逑ＲＡＬＦ多肽對(duì)子葉下胚軸的伸長(zhǎng)也存在抑制作用。在多肽ＲＡＬＦｌ存在的情逡逑況下，黑暗中萌發(fā)的擬南芥幼苗下胚軸伸長(zhǎng)受到抑制。當(dāng)幼苗重新在正常培養(yǎng)基逡逑上生長(zhǎng)時(shí)，下胚軸伸長(zhǎng)恢復(fù)（Ｍｉｎｇｏｓｓｉｅｔａｌ，２０１０）。人工合成的ＲＡＬＦ１９，２２，２３，逡逑２４，邋３１，３３和３４，或過表達(dá)Ａｔ／Ｌ４ＬＦ八也對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)具有抑制作用。但是，逡逑ＲＡＬＦ４對(duì)下胚軸或主根的細(xì)胞伸長(zhǎng)沒有任何影響（Ｅｖａｎｅｔａｌ，２０１４）。這些觀察逡逑－結(jié)果有力地支持了邋ＲＡＬＦ抑制擬南芥生長(zhǎng)和發(fā)育過程中細(xì)胞伸長(zhǎng)的假設(shè)。逡逑與兄４ＬＦ７的過表達(dá)相似，／＾Ｚ＜Ｆ２３過表達(dá)植株表現(xiàn)出生長(zhǎng)減弱、矮化、分枝逡逑增加的表型（Ｂｅｒｇｏｎｃｉｅｔａｌ，２０１４）。值得注意的是，在蕓苔素內(nèi)酯（ＢＲ）存在逡逑的情況下

邐Ｐｏｌｌｅｎ邋ｔｕｂ＾＾逡逑Ｆｅｍａｌｅ邋ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅ逡逑圖１，２邋ＲＡＬＦ－ＦＥＲ在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ邋ｅｔａｌ，邋２０１８）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋ＲＡＬＦ－ＦＥＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ａｎｄ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ逡逑（Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ邋ｅｔ邋ａｌ，邋２０１８）逡逑１．１．４邋ＲＡＬＦ及其受體ＦＥＲ在植物生物和非生物脅迫中的功能逡逑ＲＡＬＦｓ在生物和非生物脅迫中的作用主要依賴于其受體激酶ＦＥＲ實(shí)現(xiàn)。而逡逑在不同的脅迫響應(yīng)中，ＲＡＬＦｓ具有不同的作用以及分子機(jī)制。有研究表明，ＦＥＲ逡逑直接參與植物的先天免疫。ＦＥＲ作為支架蛋白能夠促進(jìn)病原體相關(guān)分子模式逡逑（ＰＡＭＰ）受體ＦＬＳ２或ＥＦＲ與ＢＡＫ１結(jié)合以分別響應(yīng)ｆｌｇ２２和ｅｌｆｌ８兩種ＰＡＭＰ，逡逑從而正調(diào)控植物防御。但是處理多肽ＲＡＬＦ２３之后，抑制了邋ＦＬＳ２／ＥＦＲ－ＢＡＫ１復(fù)逡逑合體的形成，并阻斷了邋ＲＯＳ爆發(fā)等免疫反應(yīng)（Ｓｔｅｇｍａｎｎｅｔａｌ，２０１７）。但是逡逑突變體則對(duì)ＲＡＬＦ多肽抑制先天免疫反應(yīng)不敏感，說明與ＲＡＬＦ１邋—樣，成熟逡逑ＲＡＬＦ２３多肽的形成需要經(jīng)歷前體ＲＡＬＦ分泌，以及后續(xù)Ｓ１Ｐ加工，切割后的成逡逑熟多肽與ＦＥＲ的胞外域結(jié)合

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本文編號(hào)：2809321