大麗花原產(chǎn)于墨西哥高原地區(qū),性喜陽光、涼爽且通風(fēng)良好環(huán)境,而我國南方地區(qū)夏季高溫潮濕的氣候條件嚴(yán)重影響大麗花的正常生長及園林應(yīng)用。前人研究證明外源水楊酸能夠有效提高大麗花耐熱性,但對其脅迫響應(yīng)調(diào)控機(jī)理尚不清楚。為此,本研究以大麗花‘單瓣黃’品種為材料,采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,分離與鑒定大麗花高溫脅迫及外源水楊酸調(diào)控響應(yīng)相關(guān)蛋白。利用分子生物學(xué)技術(shù),克隆熱激蛋白基因,并分析其表達(dá)特征,以闡明大麗花高溫脅迫響應(yīng)及外源水楊酸調(diào)控的分子機(jī)理。本研究取得的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.以大麗花盆栽苗盛花期的花瓣和葉片為材料,應(yīng)用SDS-PAGE和LC-MS/MS方法,分別從花瓣和葉片中成功分離、鑒定了368個(gè)和456個(gè)蛋白質(zhì)。GO分析結(jié)果表明:花瓣和葉片在分子功能注釋中分別有356個(gè)和451個(gè)蛋白質(zhì)有相應(yīng)的分類號,主要涉及蛋白質(zhì)的結(jié)合活性、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、電子載體活性及抗氧化活性等分子功能;花瓣和葉片在生物過程注釋中分別有360個(gè)和448個(gè)蛋白質(zhì)有對應(yīng)的分類號,主要參與細(xì)胞過程、代謝過程、單生物過程、生物調(diào)控、應(yīng)激響應(yīng)以及定位等生物過程;花瓣和葉片在細(xì)胞組分注釋中分別有342個(gè)和437個(gè)蛋白質(zhì)具有相應(yīng)的定位,主要位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、大分子復(fù)合物、細(xì)胞核。2.以盛花期大麗花盆栽苗為材料,于人工氣候箱進(jìn)行35℃高溫處理,以25℃常溫為對照,利用酚提取法提取大麗花花瓣總蛋白,采用IPG/SDS-PAGE方法,經(jīng)銀染和考染顯色分析,共檢測到顯著差異(2倍以上)表達(dá)斑點(diǎn)50個(gè),其中上調(diào)表達(dá)37個(gè)蛋白,下調(diào)表達(dá)13個(gè)蛋白。選擇表達(dá)量高、且分離清晰的蛋白斑點(diǎn)24個(gè),經(jīng)MALDI-TOF-MS/MS分析,成功鑒定了19個(gè)已知功能蛋白,其中抗性相關(guān)蛋白13個(gè),細(xì)胞骨架形成蛋白2個(gè),代謝相關(guān)蛋白4個(gè)。3.對35℃高溫脅迫下大麗花花瓣外施SA處理,以噴施清水為對照組,1周后,應(yīng)用SDS-PAGE、Shotgun-LC/MS方法,從大麗花花瓣4條差異凝膠條帶中,分別鑒定得到131、73、123和152個(gè)差異蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),主要包括結(jié)合活性、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、電子載體、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、抗氧化活性等分子功能;分別參與細(xì)胞過程、代謝過程、應(yīng)激響應(yīng)、單生物過程、生物調(diào)控等生物過程;主要分布在細(xì)胞器、細(xì)胞、細(xì)胞膜、大分子復(fù)合物、隔膜、細(xì)胞鏈接處、細(xì)胞間隙、細(xì)胞核等部位。KEGG分析其代謝途徑主要涉及光合固碳過程、糖酵解、乙醛酸和二羧酸代謝、氧化磷酸化、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氮代謝等。4.采用分子生物學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù),從大麗花花瓣中克隆了熱激蛋白家族4個(gè)基因的c DNA序列,分別命名為DpHSP90、DpHSP70、DpCPN60和DpHSP17。DpHSP90基因的編碼區(qū)序列為750 bp,編碼249個(gè)氨基酸殘基和1個(gè)終止密碼子;DpHSP70基因的編碼區(qū)序列為705 bp,編碼234個(gè)氨基酸殘基和1個(gè)終止密碼子;DpCPN60編碼區(qū)序列為1569 bp,編碼522個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)終止密碼子;DpHSP17編碼區(qū)序列為516 bp,編碼171個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)終止密碼子。同源性分析表明,大麗花等菊科植物中熱激蛋白家族成員基因序列相當(dāng)保守。5.采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),對大麗花熱激蛋白基因DpHSP90、DpHSP70、DpCPN60和DpHSP17的表達(dá)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,四個(gè)基因在花瓣中均有表達(dá),并且在高溫脅迫下4個(gè)基因的差異表達(dá)顯示相同的傾向,即外施SA組的表達(dá)量最高,高溫脅迫組表達(dá)量次之,常溫對照組表達(dá)量較低,表明4個(gè)熱激蛋白屬于大麗花高溫脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白,外源SA參與了熱激響應(yīng)的調(diào)控,可以提高植物的抗逆性,從而緩解高溫脅迫對大麗花的傷害。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S682.261
【部分圖文】：

6圖 1.1 植物高溫脅迫響應(yīng)表達(dá)途徑[50]Fig 1.1 Plant adaptations towards high thermotolerance

Fig 1.2 Expression regulation of HSPs[115].4 研究目的與意義研究主要采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，構(gòu)建大麗花高溫脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)麗花花瓣高溫脅迫及 SA 調(diào)控響應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的差異表達(dá)、差異蛋白質(zhì)的用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆大麗花高溫脅迫響應(yīng)相關(guān)基因，分析基因序列化關(guān)系、高溫脅迫相關(guān)基因的表達(dá)特征，以便從蛋白質(zhì)組學(xué)水平探討大脅迫響應(yīng)及外源水楊酸調(diào)控耐熱性的分子機(jī)制，為觀賞植物高溫脅迫響供新的生物信息。

溫脅迫響應(yīng)機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 第三章.2.2 高溫脅迫下大麗花花瓣蛋白表達(dá)譜的 2-DE 分析集不同溫度處理后大麗花花瓣，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳（2-DE），得到了晰、分離效果較好的電泳圖譜。圖譜顯示蛋白質(zhì)組分主要分布在等電點(diǎn) PI分子量在 18.4-66.2 kD 的范圍內(nèi)（圖 3.2）。根據(jù) 2-DE 圖譜分析軟件 Imager 5.0 的分析結(jié)果，蛋白質(zhì)表達(dá)量差異在 2 倍以上的斑點(diǎn)共有 114 個(gè)，其中在銀染中均表現(xiàn)為 2 倍以上的斑點(diǎn)有 50 個(gè)，處理組 DH 相對于對照組 CK 上的有 37 個(gè)蛋白斑點(diǎn)，下調(diào)表達(dá)有 13 個(gè)蛋白班點(diǎn)。

本文編號：2809264