梨屬于薔薇科(Rosaceae)配子體自交不親和性果樹,而‘金墜梨’是由自交不親和的‘鴨梨’芽變而來,是自交親和性品種。前人研究表明,非S因子的突變導(dǎo)致了‘金墜梨’的自交親和。但導(dǎo)致‘金墜梨’自交親和性突變的非S因子及其作用機制均尚未有報道。因此,本研究中以‘鴨梨’和‘金墜梨’為試材,采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),在‘金墜梨’中篩選出了與自交不親和性相關(guān)的基因PbTM9SF3。首先,對PbTM9SF3基因進行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析,同時并采用qRT-PCR技術(shù)對其進行了時空表達分析;其次,對PbTM9SF3基因進行了亞細胞定位;最后,通過酵母互作實驗驗證PbTM9SF3基因的功能,獲得了如下研究結(jié)果:1.利用iTRAQ技術(shù)對‘鴨梨’和‘金墜梨’花粉蛋白進行測序,篩選出489個差異表達蛋白,其中上調(diào)表達149個,下調(diào)表達340個。生物信息學(xué)分析表明,差異表達蛋白主要參與一些代謝途徑。從差異表達蛋白中篩選出PbTM9SF3基因,設(shè)計引物并在‘金墜梨’中克隆PbTM9SF3基因,其核苷酸序列全長為1782 bp。PbTM9SF3基因別稱EMP70,屬于一種跨膜超家族蛋白(TM9SF)。經(jīng)蛋白結(jié)構(gòu)域分析,PbTM9SF3基因含有1個大的非胞質(zhì)區(qū)、9個跨膜區(qū),推測其可能作為一種通道和運輸小分子的運輸器;由氨基酸序列比對可知,PbTM9SF3基因的序列在進化過程中高度保守;系統(tǒng)進化樹分析表明,該基因與基因MdTM9SF3被聚類為一支,氨基酸序列同源性達98%2.實時熒光定量PCR研究發(fā)現(xiàn),PbTM9SF3基因在‘金墜梨’花粉中的表達量遠高于其葉片和花柱;在花粉中,‘金墜梨’的表達量遠高于‘鴨梨’,表明PbTM9SF3基因與‘金墜梨’自交親和性的改變有關(guān)。3.采用基因槍轟擊的方法,將受控于CAMV 35s啟動子的攜帶有GFP報告基因和PbTM9SF3基因的PEZS-NL載體瞬時轉(zhuǎn)化進洋蔥內(nèi)表皮細胞中。在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白(GFP)存在于細胞質(zhì)膜上,表明該蛋白是一個膜蛋白。4.為了驗證PbTM9SF3基因在自交親和反應(yīng)中的功能,從‘金墜梨’中克隆PbTM9SF3基因、PbS_(21)-RNase基因和PbS_(34)-RNase基因,采用酵母互作的方法研究PbTM9SF3蛋白與PbS_(21)-RNase蛋白、PbS_(34)-RNase蛋白是否發(fā)生互作。試驗結(jié)果顯示,與AD-PbTM9SF3、BD-PbTM9SF3兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的酵母菌不能正常生長,提示PbTM9SF3與兩個S-RNase在酵母互作中不互作。
【學(xué)位單位】：河北科技師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S661.2
【部分圖文】：

9圖 2-1 實驗方法流程圖Fig.2-1 The flowchart of experimental method基因的 qRT-PCR 驗證取及檢測溫保存的花粉提取‘金墜梨’花粉的總 RNA，用 RNA 提取試劑盒（購自 TIANGEN 公司），具體進行。使用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總 RN余的溶液-80℃保存?zhèn)溆谩?

圖 2-2 蛋白質(zhì)組生物信息標準分析流程圖Fig.2-2 Flowchart for proteomic bioinformatics standard analysis結(jié)果與分析 花粉蛋白質(zhì)鑒定及定量結(jié)果 BCA 蛋白質(zhì)定量法對‘鴨梨’和‘金墜梨’花粉樣品進行定量，其為 30 μg，經(jīng) SDS-PAGE 電泳分離后，發(fā)現(xiàn)樣品蛋白質(zhì)的條帶較為均良好（圖 2-3a）。采用 LC-ESI-MS/MS 方法在 1%的陽性結(jié)果錯誤率（very Rate，F(xiàn)DR）過濾的標準下，經(jīng)質(zhì)譜分析及 Mascot 查庫，共鑒定 條多肽片段和 4680 個蛋白，唯一多肽片段 13781 個，多肽片段高達 82-2）。對鑒定得到的 4680 個蛋白依據(jù)其相對分子質(zhì)量進行統(tǒng)計，其白的分子質(zhì)量為 20～60 ku 和大于 100 ku（圖 2-3b）。按照差異蛋白變化倍數(shù) ≥ 1.2，Q-value ≤ 0.05）進行篩選，共獲得 489 個差異表達

圖 2-3 iTRAQ 鑒定蛋白的概況Fig.2-3 Overview of iTRAQ identification proteina)：樣品 SDS-PAGE 電泳圖；b)：鑒定蛋白的質(zhì)量分布圖圖 2-4 顯著差異蛋白火山圖Fig.2-4 Volcano of differentially expressed proteins紅點為顯著上調(diào)蛋白，綠點為顯著下調(diào)蛋白，灰點為無顯著變化蛋白。

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