蠟梅(Chimonanthus praecox L.)為我國著名傳統(tǒng)花木,其花香馥郁,盛開于萬物凋零的冬季,樹姿優(yōu)美,廣泛用于切花、綠植、園林栽培和工業(yè)香料生產(chǎn),有極高的綠化及商業(yè)價值。本研究基于前人對有香蠟梅株系H29和無香蠟梅株系SW001不同時期的花香揮發(fā)物質(zhì)測定結(jié)果,結(jié)合H29和SW001轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選得到在兩種材料中差異表達的萜烯合成酶基因CpTPS10和CpTPS14,結(jié)合實時定量表達分析和揮發(fā)物質(zhì)測定結(jié)果分析,尋找基因表達量與物質(zhì)揮發(fā)量之間的關(guān)系。隨后對這兩個基因的cDNA、gDNA以及啟動子序列進行了克隆,通過生物學分析初步判斷二者為倍半萜類基因。通過構(gòu)建pCAMBIA2300雙元載體,轉(zhuǎn)化早花煙草對其進行初步的功能驗證,主要成果如下:1、在有香蠟梅H29和無香蠟梅SW001花香揮發(fā)物質(zhì)檢測中發(fā)現(xiàn)萜烯類物質(zhì)有顯著差異,推測在萜烯代謝途徑下游的萜烯合酶基因(TPS)對花香差異有著重要影響。通過對蠟梅H29、SW001兩株系轉(zhuǎn)錄組庫數(shù)據(jù)分析,確定TPS差異表達基因CpTPS10和CpTPS14。對蠟梅開花發(fā)育5個時期的花器官樣品做CpTPS10和CpTPS14實時定量表達分析,發(fā)現(xiàn)CpTPS10和CpTPS14基因在H29和SW001蠟梅中表達趨勢確實有所差異。2、分別克隆得到H29和SW001兩個株系蠟梅中的CpTPS10和CpTPS14兩個基因的cDNA序列,發(fā)現(xiàn)均無差異;構(gòu)建分子進化樹,兩個基因均聚類于TPS-a亞家族。3、分別克隆H29和SW001中CpTPS10和CpTPS14基因的gDNA序列發(fā)現(xiàn):CpTPS10的gDNA序列在H29中有7個外顯子,6個內(nèi)含子;而在SW001中無內(nèi)含子,序列與cDNA序列完全一致。CpTPS14的gDNA序列在H29和SW001中均有6個外顯子,5個內(nèi)含子,二者間有69個堿基的差異和兩段分別為14bp和51bp的缺失,兩段缺失均在內(nèi)含子部分。4、分別克隆H29和SW001中CpTPS10和CpTPS14基因的啟動子序列發(fā)現(xiàn):CpTPS10啟動子在H29和SW001中有26個堿基差異,在H29中特有的順式反應(yīng)元件ABRE3a、ABRE4和chs-CMA2a,可能與脫落酸響應(yīng)和光響應(yīng)有關(guān)。SW001中特有的MBS和O2-site分別為參與干旱誘導(dǎo)的MYB位點和參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控的順式作用調(diào)控因子。CpTPS14啟動子在H29和SW001中有5個堿基差異以及一個5bp的片段差異,在啟動子順式響應(yīng)元件的種類上無差異,SW001較H29多出2個TATA-box。5、構(gòu)建雙元表達載體,采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草植株,獲得超量表達CpTPS10、CpTPS14的煙草植株,進行GC-MS香氣成分鑒定,發(fā)現(xiàn)在CpTPS10的轉(zhuǎn)基因煙草中倍半萜石竹烯和4,5-di-epi-馬兜鈴烯的含量相較于對照有顯著提高,CpTPS14的轉(zhuǎn)基因煙草中單萜芳樟醇和倍半萜4,5-di-epi-馬兜鈴烯均有顯著提升,但芳樟醇含量提升最為顯著,為對照的6.8倍。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S685.99
【部分圖文】：

圖 1.萜類化合物 VOC 合成路徑示意圖（Natalia Dudareva et al 2012）Fig.1 Schematic Map of VOC Synthesis Path of Terpenoids（Natalia Dudareva et al2012）.2.3 單萜/倍半萜合成酶基因研究進展萜烯合成酶（TPS）是萜烯類物質(zhì)合成中下游的關(guān)鍵合成酶，由于其數(shù)量龐，種類繁多，構(gòu)成了 TPS 基因家族。根據(jù)已知的基因組序列和萜烯合成酶氨酸序列的相似程度，可將植物 TPS 基因家族劃分成 TPSa-g，7 個亞家族Bohlmann et al 1998,Dudareva et al 2003）。其中 TPS-c 是最原始的一類萜烯合酶分支，被子植物萜烯合酶主要集中在 TPS-a、TPS-b、TPS-g 中（Chen et al011），參與植物次生代謝的萜烯合酶主要分布于 TPS-a、TPS-b、TPS-d、TPS-g中，被子植物的單萜合酶主要分布在 TPS-b 亞家族，裸子植物的單萜合酶主要布在 TPS-d 亞家族中，TPS-f、TPS-g 這兩個亞家族也包含部分的單萜合酶（徐

H29、SW001 基因組量標記； 1：H29 gDNA；2 H 29, SW001 genomicular weight marker; 1:H 29 H29、SW001 蠟梅花朵總 RNA（1：芽期；2：6：芽期；7：露瓣期；8： of the Wintersweet flowNA (1: bud stage;2: petal b 52000b1000b

1X TAE 和 1%1X TBE 瓊脂糖凝膠跑膠圖片可見基因組 DNA 條帶明亮單一顯拖帶，質(zhì)量較好（圖 2）；總 RNA 的 28S 和 18S 條帶明亮、清晰，并且S 的亮度在 18S 條帶的兩倍以上（圖 3），質(zhì)量合格可用于后續(xù)實驗。M 1 21Kb圖 2 H29、SW001 基因組 DNA 檢測M： 1Kb 分子量標記； 1：H29 gDNA；2：SW001 gDNA；Fig 2 H 29, SW001 genomic DNAdetectionM:1Kb molecular weight marker; 1:H 29 gDNA; 2:SW001 gDNA;M 1 2 3 4 5

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本文編號：2807408