辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781蛋白結(jié)構(gòu)的解析

發(fā)布時間：2020-08-28 06:57

【摘要】：辣椒疫霉是一種重要的植物病原卵菌,侵染寄主廣泛,常危害辣椒、番茄、茄子、瓜類等多種農(nóng)作物。在與寄主互作過程中,辣椒疫霉會分泌大量效應(yīng)分子干擾植物的防衛(wèi)反應(yīng),促進(jìn)病原菌的侵染和定殖。研究植物與病原卵菌互作的分子機制,從分子水平上揭示植物的抗病機理,對病害防治有重要意義,而結(jié)構(gòu)為我們理解效應(yīng)分子與植物互作提供了一個新視角。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)Rx LR19781是辣椒疫霉的一個效應(yīng)分子,利用PVX載體和瞬時表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)其能抑制Bax和CRN4誘導(dǎo)的本氏煙細(xì)胞死亡,因此選擇該蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究。本研究利用PCR技術(shù)克隆效應(yīng)基因RxLR19781至pET28a表達(dá)載體;運用原核表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主,利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá);運用親和層析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析進(jìn)行純化;借助坐滴法篩選蛋白晶體;通過X-ray衍射收集數(shù)據(jù),解析三維結(jié)構(gòu)。主要研究結(jié)果如下:(1)從辣椒疫霉基因組中篩選并成功克隆了RxLR19781基因,Rx LR19781蛋白完全符合Rx LR效應(yīng)分子的特征:N端1~20個氨基酸是信號肽序列,其后是RxLR-DEER保守區(qū),C端為效應(yīng)區(qū);(2)構(gòu)建了RxLR19781的pET28a原核表達(dá)載體,通過將蛋白融合His標(biāo)簽,成功將其在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行了表達(dá);(3)通過Ni~(2+)親和層析柱純化,發(fā)現(xiàn)重組載體表達(dá)出目的蛋白可溶。Rx LR19781蛋白經(jīng)Ni~(2+)柱親和層析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析后,得到了高純度的且均一性較好的目的蛋白;(4)通過坐滴氣象擴散法,采用Hampton結(jié)晶試劑盒進(jìn)行蛋白晶體篩選,得到了高分辨率的Rx LR19781母體和硒代蛋白晶體,并在上海進(jìn)行了X-ray衍射數(shù)據(jù)的收集,解析出Rx LR19781的三維結(jié)構(gòu)。本論文的研究結(jié)果對了解效應(yīng)蛋白與寄主植物的互作機制提供了重要的實驗數(shù)據(jù),對構(gòu)建新型病害防控策略提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.418
【圖文】：

域結(jié)構(gòu),效應(yīng)因子

圖1-2 RXLR效應(yīng)因子的WY域結(jié)構(gòu)性保守比對圖（Win et al., 2012）Fig. 1-2 Crystal structures of the C-terminal regions of RXLR-type oomycete effectorsematic representations showing the modularity and structures of (a) AVR3a11 (AVR3a4 adopts essentially the samecture), (b) PexRD2 and (c) ATR1. The black bars represent the regions of the protein sequence that were crystallized.-helices of the WY domain in each structure are shown in red and labelled a2, a3 and a4; for AVR3a11 and ATR1 theerminal helix that forms the 4-helix bundle is also shown in red (a1). For clarity, in (b), helices not part of the core WY

信號肽,預(yù)測結(jié)果,氨基酸