發(fā)布時間：2020-08-22 08:08

【摘要】：梨是我國第三大果樹,栽培面積與產(chǎn)量均僅次于蘋果和柑橘。梨在冬季存在芽休眠現(xiàn)象,芽休眠表現(xiàn)為可見生長的暫停,是包括落葉果樹在內(nèi)的多年生木本植物特有的生理現(xiàn)象,能使植物免于低溫傷害,安全度過寒冬。根據(jù)引起芽休眠的因素不同將其分為類休眠、內(nèi)休眠和生態(tài)休眠。處于內(nèi)休眠狀態(tài)的果樹,即使處于適合生長的環(huán)境條件下也不能萌芽,必須經(jīng)過一定時長的低溫積累才能度過內(nèi)休眠,恢復(fù)生長能力。內(nèi)休眠解除后,依然處于生長抑制狀態(tài),待氣溫逐漸回升,外界環(huán)境條件適合后恢復(fù)生長。當(dāng)果樹進入內(nèi)休眠狀態(tài)后,如果冬季低溫積累量不能達到需冷量最低要求,樹體將無法正常度過內(nèi)休眠,次年將會出現(xiàn)開花不整齊,花朵育性下降等現(xiàn)象,最終影響果實生產(chǎn),因此探明芽休眠的調(diào)控機制對果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本論文通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)休眠過程中激素相關(guān)基因變化顯著,特別是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因,接下來研究了'酥梨'花芽休眠過程中ABA含量變化及外源ABA處理離體枝條的效應(yīng)來探究其在休眠過程中的作用,進一步檢測了 ABA下游基因CBF對DAM的調(diào)控,另外,發(fā)現(xiàn)油菜素甾醇(BR)可能在ABA上游起作用,部分闡明了 ABA及相關(guān)激素調(diào)控梨芽休眠的分子機制。主要結(jié)果如下:1)選取休眠不同階段'酥梨'花芽進行二代測序,混樣后進行三代測序。用二代測序結(jié)果對三代結(jié)果進行校正后,將三代結(jié)果與梨基因組進行比對,得到34,996個轉(zhuǎn)錄本,其中21,799個為已知轉(zhuǎn)錄本的可變剪接形式,另外鑒定到的基因每個有1.89個剪接體,顯著高于基因組。二代測序結(jié)果比對數(shù)據(jù)庫后,篩選到差異表達基因16,448個,通過mfuzz聚類分析,篩選到20個植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因,其中11個為ABA信號通路相關(guān)基因,推測ABA可能是調(diào)控梨芽休眠進程的重要因子。因此我們檢測了休眠過程中'酥梨'花芽ABA含量,發(fā)現(xiàn)其含量在內(nèi)休眠開始階段上升,內(nèi)休眠階段一直處于較高水平,之后隨著內(nèi)休眠的解除,ABA含量逐漸降低。在類休眠到內(nèi)休眠階段,ABA合成關(guān)鍵基因PpNCED-2和PpNCED-3高表達,而在這個過程中ABA代謝相關(guān)基因PpCYP707As表達較低。然而,隨著內(nèi)休眠的推進,PpCYP707A-3在低溫積累過程中表達迅速升高,與此同時,ABA含量降低,萌芽率迅速增加。PpPYLs、PpPP2Cs、PpSnRK2s和PpABI4/PpABI5s也隨ABA含量變化而變化。另外,外源ABA處理類休眠梨花芽可以顯著降低其萌芽率,促進內(nèi)休眠誘導(dǎo)。在整個處理過程中ABA處理組的PpPP2C-12表達顯著低于對照組,而PpSnRK2-1、PpSnRK2-4和PpABI5-1的表達高于對照組。我們的結(jié)果表明PpCYP707A-3和PpNCEDs可能在調(diào)控內(nèi)休眠誘導(dǎo)、維持和解除過程中發(fā)揮重要作用,同時ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也在此過程中發(fā)揮一定作用。2)由于CBF位于ABA下游,CBF又可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控DAM基因的表達。為研究ABA是否通過CBF來調(diào)控休眠進程,我們在高需冷量品種'圓黃'中鑒定得到了 4個PpCBF和3個PpDAM基因,并且檢測了他們在自然休眠和人工低溫處理條件下的表達模式。在自然休眠過程中PpDAM1的表達在低溫積累開始就持續(xù)下調(diào),而另外兩個DAM和三個CBF基因在內(nèi)休眠解除過程中達到表達高峰;在低溫處理過程中PpDAM1、PpDAM2和PpCBF1的表達趨勢與自然條件下的相似。不同的生化試驗結(jié)果都表明PpCBF2/4可結(jié)合PpDAM1的啟動子并激活其表達,PpCBFl/4可激活PpDAM3。有趣的是我們發(fā)現(xiàn)PpCBF2可以通過直接結(jié)合PpCBF3/4啟動子來激活他們的表達。結(jié)合課題組的其他試驗結(jié)果,發(fā)現(xiàn)ABA可以通過CBF間接激活DAM基因的表達,同時我們鑒定到了調(diào)控內(nèi)休眠的CBF和DAM基因主要為PpCBF1和PpDAM2。3)以'酥梨'為研究材料,利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS-MS)的方法分析了其自然休眠過程中BR含量的變化,由于BR含量較低,最后只鑒定到香蒲甾醇,其在休眠過程中變化不大。之后,我們通過實時定量PCR的方法研究了 BR相關(guān)基因在休眠過程中的表達情況,發(fā)現(xiàn)了一些差異表達的基因,這些基因可能在休眠調(diào)控過程中發(fā)揮一定的作用。通過對不同休眠階段枝條施加外源油菜素內(nèi)酯發(fā)現(xiàn),當(dāng)梨芽有一定的低溫積累,油菜素內(nèi)酯可以部分彌補低溫積累量的不足,說明其具有作為破眠劑的潛在應(yīng)用價值。最后,我們研究了油菜素內(nèi)酯處理枝條中BR/GA/ABA相關(guān)基因的表達模式,發(fā)現(xiàn)油菜素內(nèi)酯處理可以抑制ABA合成基因NCED的表達,同時促進ABA降解基因CYP707A的表達;另外,油菜素內(nèi)酯處理枝條中GA合成基因GA20ox上調(diào),GA降解基因GA2ox下調(diào),說明BR可能是通過平衡ABA與GA之間的含量來促進破眠。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S661.2
【圖文】：

．２．２．１三代測序數(shù)據(jù)情況匯總及數(shù)據(jù)質(zhì)控逡逑本研究中，我們在ＰａｃＢｉｏ平臺上測序了邋１個樣本，在總共８個ＳＭＲＴ邋ｃｅｌｌ逡逑（長度分別為１－２邋Ｋ、２－３邋Ｋ、３－６邋Ｋ）的測序中得到８８６，１６５，６０７邋ｂｐ的原始數(shù)據(jù)逡逑（３３６，１７３邋ｒｅａｄｓ），不同ｃｅｌｌ中平均讀長均在合適范圍內(nèi)，并且質(zhì)量均大于０．９８，逡逑滿足測序要求，詳細的匯總信息見表２．２和圖２．２。逡逑表２．２測序愫況匯總表逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．２邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｓｕｍｍａｒｙ逡逑Ｌｉｂｒａｒｙ邋Ｃｅｌｌ邋Ｒｅａｄｓ邋ｏｆ邋Ｒｅａｄ邋Ｂａｓｅｓ邋Ｍｅａｎ邋Ｒｅａｄ邋Ｌｅｎｇｔｈ邋ｏｆ邋Ｍｅａｎ邋Ｒｅａｄ逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋Ｉｎｓｅｒｔ邋ｏｆ邋Ｉｎｓｅｒｔ（ｂｐ）邐Ｉｎｓｅｒｔ（ｂｐ）邐Ｑｕａｌｉｔｙ邋ｏｆ邋Ｉｎｓｅｒｔ逡逑１－２邋Ｋ邐３邐１４４，３７１＂＂＂２６６，８５７，７１７邐１，８４８邐０９９逡逑２－３邋Ｋ邐３邐１２５，７２１邐３６３，０６８，５７０邐２，８８８邐０．９９逡逑３－６邋Ｋ邐２邐６６，０８１邐２５６，２３９，３２０邐３，８７８邐０．９８逡逑邐ＨＭｎｇｗｗｔｅｔｌｌｅａｄｉＯｔｌｎＭｒｔＣｔｏＭＢｒ邐邋邐ＨｉＭｏｙｎ邋ｌｏｒ邋ＣＸ邋ｔｍｃｒｔ邋ＯｍＷｙ邐邋邐邐Ｈｔａｔｏｉｍｎ邋？ａ？邋Ｏｔ邋Ｉｒａｗｌ邋ＱｍＷｙ邐逡逑￣

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剪接分為四種類型：可變轉(zhuǎn)錄起始位點（Ａ５’），可變轉(zhuǎn)錄終止位點（Ａ３’），內(nèi)含逡逑子保留ＯＲ），外顯子跳躍（ＳＥ）。三代測序結(jié)果中的ＩＲ數(shù)量顯著高于參考基因逡逑組，其他三種類型數(shù)量相近（圖２．５）。逡逑邐Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ邋Ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋Ｅｖｅｎｔ邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邐逡逑１５０００逡逑Ｉ邐｜逡逑ＩＵ邋１００００邐：邋．：■邋Ｃｌａｓｓ逡逑Ｑ邋ＩｓｏＳｅｑ逡逑ｍ邋Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ逡逑＇ｉＬｌＬＪ逡逑Ａ３＇邐Ａ５１邐ＩＲ邐ＳＥ邐Ｔｏｔａｌ逡逑Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ邋Ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋Ｅｖｅｎｔ邋Ｔｙｐｅ逡逑圖２．５可交努接事件分布圖逡逑Ｆｉｇ．邋２．５邋Ｆｉｇｕｒｅ邋ｏｆ邋ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋ｅｖｅｎｔ邋ｔｙｐｅｓ逡逑２．２．５新轉(zhuǎn)錄本編碼能力預(yù)測逡逑在本研究中，各樣本中我們鑒定到３２３７７個新轉(zhuǎn)錄本，其中２９４２７個為逡逑ｕｎｍａｐｐｅｄ或者低ｍａｐｐｉｎｇ邋ｃｏｖｅｒａｇｅ的轉(zhuǎn)錄本，２３邋０４個為鑒定為基因間區(qū)的序列，逡逑６４６個為反義鏈轉(zhuǎn)錄本。通過ＣＰＣ，ＣＰＡＴ，ＰＬＥＫ三款預(yù)測軟件，我們檢測到２３５２１逡逑個新轉(zhuǎn)錄本具有編碼能力，９２２９個轉(zhuǎn)錄本為ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ邋ＲＮＡ，預(yù)測結(jié)果中至少逡逑滿足兩種方法支持的才能確定為ｃｏｄｉｎｇ或者ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ轉(zhuǎn)錄本（圖２．６）。逡逑Ａ邋ＣＰＡＴ邐ＣＰＣ邋Ｂ邋ＣＰＡＴ邐ＣＰＣ逡逑１＊５６邐２８１６逡逑２６７邐２１Ｍ邐３ｔＣ？邐９９０逡逑＿邐腳逡逑ｔｆＯ邐３Ｍ４邐２１Ｍ邐２６７逡逑３＞１６邐ＩＭＳ逡逑ＰＬＥＫ邐ＰＬＥＫ逡逑Ｃｏｄｉｎｇ邐Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ逡逑２５逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

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本文編號：2800453