【摘要】：本研究為國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31670344)及中央高校創(chuàng)新項(xiàng)目(2572016EAJ6)的主要研究?jī)?nèi)容。燕子花作為北方的一種抗寒性較強(qiáng)的水生花卉,具有很高的觀賞價(jià)值。目前,有關(guān)燕子花抗寒等抗性分子方面的研究很少涉及。MYBs基因家族不僅參與了植物的次生代謝反應(yīng),而且在響應(yīng)外界非生物脅迫方面同樣發(fā)揮了巨大作用。本研究以燕子花為主要研究對(duì)象,在已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,分析了燕子花MYBs基因家族,篩選并克隆了抗性基因IlMYB306,進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,檢測(cè)了 IlMYB306基因在非生物脅迫下的表達(dá)情況;同時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化到模式植物煙草中,并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了初步研究。主要研究成果如下:1.通過(guò)燕子花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),共獲得53條MYB轉(zhuǎn)錄因子序列。根據(jù)結(jié)構(gòu)域類型進(jìn)行分類,其中6條屬于1R/4R型亞家族,3條屬于3R型亞家族,20條屬于R2R3型亞家族,24條屬于MYB相關(guān)蛋白。燕子花MYB基因的序列保守程度很高,與同一亞族的MYB基因保守序列一致。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示,50條燕子花MYB蛋白作用于細(xì)胞核,c37880.graph_c0定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核,c42108.graph_c2定位于葉綠體和細(xì)胞核,c45677.graph_c0定位于細(xì)胞膜和葉綠體。通過(guò)MEME在線軟件分析R2R3-MYB蛋白序列的基序組成,鑒定出了 5個(gè)模體。將燕子花和擬南芥的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子做系統(tǒng)比較發(fā)現(xiàn)燕子花的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子不僅參與了植物對(duì)非生物脅迫響應(yīng),還參與了花青素合成等其他的次生代謝過(guò)程。最終篩選出非生物脅迫相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子并將其命名為IlMYB306。2.以燕子花的cDNA為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的基因IlMYB306。該基因全長(zhǎng)1024bp,ORF為906bp,編碼301個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示I1MYB306的分子量為33.54kDa,理論等電點(diǎn)為6.51,屬于不穩(wěn)定親水蛋白;存在兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)在細(xì)胞核中;無(wú)跨膜結(jié)構(gòu),不存在信號(hào)肽序列;含有5個(gè)糖基化位點(diǎn),3個(gè)潛在的絲氨酸磷酸化位點(diǎn),8個(gè)潛在的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),5個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn);蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示I1MYB306由37.54%的α-螺旋、5.56%的折疊延伸、3.32%的β-轉(zhuǎn)角和53.49%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成,蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符。通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的不同物種的MYB306蛋白做同源性分析,發(fā)現(xiàn)其與天門冬科蘆筍的MYB306蛋白具有較高的同源性,同源性高達(dá)99%,推測(cè)該基因除具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能外,在響應(yīng)非生物脅迫、參與細(xì)胞分化、參與脫落酸和茉莉酸的信號(hào)傳導(dǎo)等方面也發(fā)揮同樣作用。3.QRT-PCR檢測(cè)了燕子花幼苗在受到低溫(4℃)及鹽(NaCl)和干旱(PEG)不同程度脅迫誘導(dǎo)時(shí)IlMYB306基因在幼苗根和葉中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示在3種脅迫下燕子花IlMYB306基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比均有變化,充分證明該基因參與了燕子花的逆境響應(yīng),并且IlMYB306基因在根中的表達(dá)量比葉要高。在冷脅迫下IlMYB306基因呈上調(diào)表達(dá),且整體表達(dá)量高于干旱和鹽脅迫表達(dá)量;在初期干旱脅迫下的表達(dá)量上升最快,但是隨著脅迫時(shí)間的增長(zhǎng),該基因的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì);鹽脅迫下,該基因在葉片中呈下調(diào)表達(dá),在脅迫初期根中的表達(dá)量增加倍數(shù)較低且隨著脅迫加劇呈現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)�？梢哉J(rèn)為IlMYB306基因具有抗寒功能,推測(cè)其響應(yīng)干旱及鹽脅迫。4.構(gòu)建pBI121-IlMYB306-GFP植物表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入野生型煙草,通過(guò)Kana抗性篩選和PCR鑒定,獲得了轉(zhuǎn)基因煙草幼苗。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量的檢測(cè),證明了轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的表達(dá)量明顯高于野生型。對(duì)轉(zhuǎn)IlMYB306基因煙草進(jìn)行原生質(zhì)體的提取,利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)I1MYB306蛋白作用于細(xì)胞核中。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S682.32
【圖文】：

雀媝＿】瞧逡逑Ｎ邐Ｃ逡逑圖２－２燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ轉(zhuǎn)錄因子的Ｒ２Ｒ３保守結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)簽逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋Ｒ２Ｒ３邋ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｌｏｇｏ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ邋ＴＦｓ邋ｉｎ邋Ｉ．邋ｌａｅｖｉｇａｔａ逡逑２．３．４燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ轉(zhuǎn)錄因子的模體分析逡逑ＭＹＢ轉(zhuǎn)錄因子中存在很多的保守序列，這些保守序列可能與ＤＮＡ的某些部位相結(jié)逡逑合，從而在表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用［＿。為了深入研究燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ轉(zhuǎn)錄因子中潛在逡逑的保守基序，我們?cè)谙到y(tǒng)研究了燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化關(guān)系的基礎(chǔ)上，通過(guò)逡逑ＭＥＭＥ在線分析軟件對(duì)Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ編碼蛋白的基序組成進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖２－３和逡逑圖２－４所示：共鑒定出了邋５個(gè)模體，模體１是ＭＹＢ蛋白的Ｎ端結(jié)構(gòu)域，幾乎存在于所逡逑有的燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ中。相對(duì)于Ｎ端來(lái)說(shuō)，Ｃ端的模體易變性較高，序列各不相逡逑同，這些特異性的基序預(yù)示著不同亞族可能具有不同的功能［１（）２］。根據(jù)Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ轉(zhuǎn)錄逡逑因子的保守基序種類和在進(jìn)化樹(shù)中的分布位置

３－２所示，條帶大小約為ｌＯＯＯｂｐ左右。測(cè)序結(jié)果顯示克隆出的目的片段序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)逡逑據(jù)中的序列完全一致，由此可證明目的基因已被成功克隆。該基因ＯＲＦ為９０６ｂｐ，編碼逡逑３０１個(gè)氨基酸，其核苷酸和氨基酸對(duì)應(yīng)表如圖３－３所示。逡逑Ｍａｋｅｒ邋Ｌｅａｆ邋Ｒｏｏｔ逡逑桯y以s{：；漏逡逑媝：＿灥＾逡逑ｐｉ｜ｌ；；ｖ，：；：：：邐－：：邋，ｖ：：：；？；５：？邋：邋■邋ｖ：，邋■■■．邋．；邋＾｜｜ｉ｜逡逑２0Ｍ邋ＨＭ逡逑ｉｏｏｏＭ＾，：－￣邋ａ邋ｉｌ逡逑７５０邋Ｉ邋’逡逑５00邐…．．二，、ｓ逡逑２５０逡逑１００邋，逡逑圖３－２目的基因的擴(kuò)增反應(yīng)逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｕｒｐｏｓｅ邋ｇｅｎｅ逡逑２２逡逑

２８ｓｌ邐ｉ邋１逡逑ｉ８ｓ｜邐１邐ｍ逡逑ｍ逡逑圖３－１燕子花總ＲＮＡ逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋／．邋ｌａｅｖｉｇａｔａ逡逑３．３．２目的基因的ｐｃｒ擴(kuò)增逡逑以燕子花的ｃＤＮＡ為模板，用特異性引物／／Ｍ７５３０６－Ｆ和進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)逡逑增，退火溫度為６５°Ｃ，反應(yīng)結(jié)束后將ＰＣＲ產(chǎn)物用１％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖逡逑３－２所示，條帶大小約為ｌＯＯＯｂｐ左右。測(cè)序結(jié)果顯示克隆出的目的片段序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)逡逑據(jù)中的序列完全一致，由此可證明目的基因已被成功克隆。該基因ＯＲＦ為９０６ｂｐ，編碼逡逑３０１個(gè)氨基酸，其核苷酸和氨基酸對(duì)應(yīng)表如圖３－３所示。逡逑Ｍａｋｅｒ邋Ｌｅａｆ邋Ｒｏｏｔ逡逑桯y以s{：；漏逡逑媝：＿灥＾逡逑ｐｉ｜ｌ；；ｖ，：；：：：邐－：：邋，ｖ：：：；？；５：？邋：邋■邋ｖ：，邋■■■．邋．；邋＾｜｜ｉ｜逡逑２0Ｍ邋ＨＭ逡逑ｉｏｏｏＭ＾

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2794417