發(fā)布時(shí)間：2020-08-14 22:29

【摘要】：生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF(auxin response factor)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育。ARF4是ARF家族成員,目前關(guān)于ARF4基因的研究?jī)H局限于擬南芥和番茄等植物,在草莓中的相關(guān)研究報(bào)道甚少。本文通過(guò)構(gòu)建FaARF4-GFP載體來(lái)明確FaARF4蛋白的細(xì)胞定位。通過(guò)構(gòu)建草莓FvARF4基因沉默載體,旨在進(jìn)一步明確ARF4基因缺失對(duì)草莓植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響。主要結(jié)果如下:1.首先從二倍體‘Ruegen’草莓中擴(kuò)增FvARF4基因編碼區(qū)序列,全長(zhǎng)為2409bp,編碼802個(gè)氨基酸。與二倍體森林草莓基因組中對(duì)應(yīng)序列相似度為99.79%;與八倍體栽培草莓FaARF4氨基酸序列一致性為99%。通過(guò)序列分析選擇333bp特異性序列作為構(gòu)建沉默表達(dá)載體的目的片段,并分別擴(kuò)增正反沉默片段。2.通過(guò)SYBR染料法qRT-PCR檢測(cè)了森林草莓‘Ruegen’不同器官中ARF4的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示在葉柄、花和葉中ARF4的表達(dá)量最高,在根和果實(shí)中次之。3.利用實(shí)驗(yàn)室已有的八倍體‘艷麗’草莓FaARF4編碼區(qū)全長(zhǎng)序列,擴(kuò)增不含終止子的2400bp的FaARF4序列。以pRI101-GFP為骨架載體,以XbaⅠ/SalⅠ為酶切位點(diǎn),成功構(gòu)建ARF4-GFP融合載體。對(duì)ARF4蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)其定位在細(xì)胞核內(nèi),屬于核蛋白。4.以pART27為表達(dá)載體、pKANNBAL載體為中間載體,利用XhoⅠ/EcoRⅠ和HindⅢ/XbaⅠ為酶切位點(diǎn),首先將長(zhǎng)度333bp的ARF4正反沉默片段插入連接到pKANNBAL上。然后利用NotⅠ進(jìn)行單酶切,將帶有ARF4沉默片段的序列與pART27載體連接,最終成功構(gòu)建草莓FvARF4基因沉默載體,命名為pRNAi-ARF4。5.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的‘葉盤(pán)法’侵染草莓葉片,將pRNAi-ARF4載體侵染到二倍體森林草莓‘Ruegen’中。通過(guò)SYBR染料法qRT-PCR定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中ARF4的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示在6株轉(zhuǎn)基因植株中ARF4表達(dá)量均明顯下調(diào)。6.通過(guò)表型觀察,發(fā)現(xiàn)FvARF4基因沉默植株葉片形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化,而表現(xiàn)出晚花現(xiàn)象和花發(fā)育缺陷:花瓣不能完全展開(kāi)。轉(zhuǎn)基因植株中果實(shí)發(fā)育易出現(xiàn)畸形,并且這些表型能夠遺傳到T1代植株中。在觀察T1代植株根系時(shí)發(fā)現(xiàn)FvARF4基因沉默T1代植株的側(cè)根數(shù)顯著少于對(duì)照。7.通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中表型相關(guān)基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)AP1,FT,SOC1和SPL3的表達(dá)量下降,FUL和ARF3的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。推測(cè)ARF4可能通過(guò)調(diào)控上述基因發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S668.4
【圖文】：

信號(hào)激活基因的過(guò)程很簡(jiǎn)單，僅僅是生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，然后ux/IAA 阻遏物募集到生長(zhǎng)素占據(jù)到/IAA 阻遏物，然后通過(guò)也可以對(duì) ARFs傳導(dǎo)過(guò)程中：當(dāng)uxRE 促進(jìn)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的抑制作用uilfoyle and Hagen, 2012途徑使 Aux/IAA其激活(Guilfoyle and Hagen, 2007反應(yīng)(Gray et al., 2001因的激活和抑制F，ARF-Aux/IAA相互作用，隔離或阻止特定直接與其他轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子lfoyle and Hagen, 2007TIR1 受體上，隨后通過(guò)泛素ARF 激活劑對(duì)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因起到激活的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)(Simonini et al., 2016; 李艷林等傳導(dǎo)過(guò)程中：當(dāng)內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度較低時(shí)，Aux/IAA 與 ARF(Tiwari et al., 20032012; Guilfoyle, 2015)；當(dāng)生長(zhǎng)素濃度升到一IAA 阻遏物降解，同時(shí)釋放 ARFs，減弱了生長(zhǎng)素應(yīng)Guilfoyle 2007;Salehin et al., 2015)，隨后植物Gray 2001)。ARF 和 Aux/IAA 蛋白之間的相互作用，因的激活和抑制作用，但除此之外也可能發(fā)生額外的調(diào)節(jié)方式。IAA 和 Aux/IAA-Aux/IAA 相互作用或 ARFARF 或 Aux/IAA 蛋白到達(dá)其靶位點(diǎn)直接與其他轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子直接相互作用，以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)lfoyle 2007; Shin et al., 2007; Guilfoyle, 2015)。通過(guò)Tiwari 2003; Gu，但除此之外也可能發(fā)生額外的調(diào)節(jié)方式。和 Au蛋白到達(dá)其靶位點(diǎn)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)

Fig.2The process of vector constructionof pRNAiF4 沉默載體的構(gòu)建的提取 pKANNBAL 載體養(yǎng)基上進(jìn)行活化 Amp（100 μg·mL（含相同的抗生素）培養(yǎng)粒、pGM-ARF4F4 正向沉默片段與NNBAL 載體和（pKANNBAL）圖2 pRNAi-ARF4表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程The pRNAi-ARF4載體和 pART-27 載體的大腸桿菌分別在含 Ka養(yǎng)基上進(jìn)行活化；將帶有 pGM-ARF4F 載體和 pGM-ARF4mL-1）的 LB 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，分別（含相同的抗生素）培養(yǎng)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取 pKAF 質(zhì)粒和 pGM-ARF4R 質(zhì)粒，詳細(xì)步驟按照pKANNBAL 載體連接和 pGM-ARF4F 載體質(zhì)粒分別用 EcoRⅠ/XhoⅠ進(jìn)15 μl 底物（pGM-ARF4F） 15 ARF4，分別選，詳細(xì)步驟按照進(jìn)

驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)phoretic result增區(qū)序列因組區(qū)rRNA 與 18S rRNA 條帶相比非常明亮驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。3‘Ruegen’草莓總 RNA 的電泳結(jié)果of total RNAof‘Ruegen’strawb增因組 cDNA 作為模板，以表 2 中的 ARF區(qū)序列，得到一條約 2400bp 左右的片strawb左右的片

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 袁友泉;李超超;許馨月;張志宏;劉月學(xué);;草莓FaAP1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及在擬南芥中的超表達(dá)[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2015年05期

2 李慧峰;冉昆;何平;王海波;常源升;孫清榮;程來(lái)亮;李林光;;蘋(píng)果生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(ARF)基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析[J];植物生理學(xué)報(bào);2015年07期

3 丁峰;彭宏祥;李鴻莉;朱建華;秦獻(xiàn)泉;沈慶慶;何新華;;植物AP1基因研究進(jìn)展(綜述)[J];亞熱帶植物科學(xué);2011年01期

4 劉春玲,林伯年;成花基因研究進(jìn)展[J];果樹(shù)學(xué)報(bào);2001年06期

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1 王矢喬;草莓ARF基因家族啟動(dòng)子預(yù)測(cè)及ARF4啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性分析[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 董向向;草莓FaARF4基因的克隆鑒定及功能分析[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2793622