【摘要】：生長素響應因子ARF(auxin response factor)是一類轉錄因子,通過調控生長素響應基因的表達來調節(jié)植物生長發(fā)育。ARF4是ARF家族成員,目前關于ARF4基因的研究僅局限于擬南芥和番茄等植物,在草莓中的相關研究報道甚少。本文通過構建FaARF4-GFP載體來明確FaARF4蛋白的細胞定位。通過構建草莓FvARF4基因沉默載體,旨在進一步明確ARF4基因缺失對草莓植株生長發(fā)育的影響。主要結果如下:1.首先從二倍體‘Ruegen’草莓中擴增FvARF4基因編碼區(qū)序列,全長為2409bp,編碼802個氨基酸。與二倍體森林草莓基因組中對應序列相似度為99.79%;與八倍體栽培草莓FaARF4氨基酸序列一致性為99%。通過序列分析選擇333bp特異性序列作為構建沉默表達載體的目的片段,并分別擴增正反沉默片段。2.通過SYBR染料法qRT-PCR檢測了森林草莓‘Ruegen’不同器官中ARF4的相對表達量,結果顯示在葉柄、花和葉中ARF4的表達量最高,在根和果實中次之。3.利用實驗室已有的八倍體‘艷麗’草莓FaARF4編碼區(qū)全長序列,擴增不含終止子的2400bp的FaARF4序列。以pRI101-GFP為骨架載體,以XbaⅠ/SalⅠ為酶切位點,成功構建ARF4-GFP融合載體。對ARF4蛋白進行亞細胞定位,發(fā)現其定位在細胞核內,屬于核蛋白。4.以pART27為表達載體、pKANNBAL載體為中間載體,利用XhoⅠ/EcoRⅠ和HindⅢ/XbaⅠ為酶切位點,首先將長度333bp的ARF4正反沉默片段插入連接到pKANNBAL上。然后利用NotⅠ進行單酶切,將帶有ARF4沉默片段的序列與pART27載體連接,最終成功構建草莓FvARF4基因沉默載體,命名為pRNAi-ARF4。5.采用農桿菌介導的‘葉盤法’侵染草莓葉片,將pRNAi-ARF4載體侵染到二倍體森林草莓‘Ruegen’中。通過SYBR染料法qRT-PCR定量檢測轉基因植株中ARF4的相對表達量,結果顯示在6株轉基因植株中ARF4表達量均明顯下調。6.通過表型觀察,發(fā)現FvARF4基因沉默植株葉片形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化,而表現出晚花現象和花發(fā)育缺陷:花瓣不能完全展開。轉基因植株中果實發(fā)育易出現畸形,并且這些表型能夠遺傳到T1代植株中。在觀察T1代植株根系時發(fā)現FvARF4基因沉默T1代植株的側根數顯著少于對照。7.通過檢測轉基因植株中表型相關基因的表達量,發(fā)現AP1,FT,SOC1和SPL3的表達量下降,FUL和ARF3的表達量沒有明顯變化。推測ARF4可能通過調控上述基因發(fā)揮作用。
【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S668.4
【圖文】：

信號激活基因的過程很簡單，僅僅是生長素轉運到細胞中，然后ux/IAA 阻遏物募集到生長素占據到/IAA 阻遏物，然后通過也可以對 ARFs傳導過程中：當uxRE 促進生長素響應基因的抑制作用uilfoyle and Hagen, 2012途徑使 Aux/IAA其激活(Guilfoyle and Hagen, 2007反應(Gray et al., 2001因的激活和抑制F，ARF-Aux/IAA相互作用，隔離或阻止特定直接與其他轉錄激活因子或抑制因子lfoyle and Hagen, 2007TIR1 受體上，隨后通過泛素ARF 激活劑對生長素響應基因起到激活的活性進行調節(jié)(Simonini et al., 2016; 李艷林等傳導過程中：當內源生長素濃度較低時，Aux/IAA 與 ARF(Tiwari et al., 20032012; Guilfoyle, 2015)；當生長素濃度升到一IAA 阻遏物降解，同時釋放 ARFs，減弱了生長素應Guilfoyle 2007;Salehin et al., 2015)，隨后植物Gray 2001)。ARF 和 Aux/IAA 蛋白之間的相互作用，因的激活和抑制作用，但除此之外也可能發(fā)生額外的調節(jié)方式。IAA 和 Aux/IAA-Aux/IAA 相互作用或 ARFARF 或 Aux/IAA 蛋白到達其靶位點直接與其他轉錄激活因子或抑制因子直接相互作用，以調節(jié)生長lfoyle 2007; Shin et al., 2007; Guilfoyle, 2015)。通過Tiwari 2003; Gu，但除此之外也可能發(fā)生額外的調節(jié)方式。和 Au蛋白到達其靶位點調節(jié)生長

Fig.2The process of vector constructionof pRNAiF4 沉默載體的構建的提取 pKANNBAL 載體養(yǎng)基上進行活化 Amp（100 μg·mL（含相同的抗生素）培養(yǎng)粒、pGM-ARF4F4 正向沉默片段與NNBAL 載體和（pKANNBAL）圖2 pRNAi-ARF4表達載體構建過程The pRNAi-ARF4載體和 pART-27 載體的大腸桿菌分別在含 Ka養(yǎng)基上進行活化；將帶有 pGM-ARF4F 載體和 pGM-ARF4mL-1）的 LB 固體培養(yǎng)基上進行活化，分別（含相同的抗生素）培養(yǎng)。使用質粒提取試劑盒提取 pKAF 質粒和 pGM-ARF4R 質粒，詳細步驟按照pKANNBAL 載體連接和 pGM-ARF4F 載體質粒分別用 EcoRⅠ/XhoⅠ進15 μl 底物（pGM-ARF4F） 15 ARF4，分別選，詳細步驟按照進

驗標準phoretic result增區(qū)序列因組區(qū)rRNA 與 18S rRNA 條帶相比非常明亮驗標準。3‘Ruegen’草莓總 RNA 的電泳結果of total RNAof‘Ruegen’strawb增因組 cDNA 作為模板，以表 2 中的 ARF區(qū)序列，得到一條約 2400bp 左右的片strawb左右的片

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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相關碩士學位論文 前2條

1 王矢喬;草莓ARF基因家族啟動子預測及ARF4啟動子的轉錄活性分析[D];沈陽農業(yè)大學;2018年

2 董向向;草莓FaARF4基因的克隆鑒定及功能分析[D];沈陽農業(yè)大學;2017年

本文編號：2793622