【摘要】：雙色百合花具有奇特的花被片,具有極高的觀賞價值。在百合‘Tiny Padhye’雙色花被片發(fā)育的過程中,花被片下部逐漸由綠色變?yōu)樽仙?而上部由綠色變?yōu)榘咨�。然�?百合雙色花形成的分子機理尚未揭示。百合雙色花形成的分子機理的揭示可以為百合花色的人工調(diào)控及百合花色分子改良提供理論依據(jù)。本研究在測定雙色百合花被片發(fā)育過程中葉綠素、花青素苷含量變化的基礎(chǔ)上,通過RNA-seq技術(shù)測定雙色花百合‘Tiny Padhye’上下部不同發(fā)育時期的花被片的轉(zhuǎn)錄組,通過生物信息學(xué)手段鑒定與葉綠素代謝以及花青素苷合成通路相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子,并對參與百合雙色花形成的關(guān)鍵基因LhUFGT和Lh SGR進行了鑒定和功能研究,從而揭示百合雙色花形成的分子機制。主要研究結(jié)果如下:1.雙色花百合‘Tiny Padhye’花被片發(fā)育過程中花青素苷和葉綠素含量變化HPLC結(jié)果表明,在百合紫色花被片下部,僅有矢車菊素3-O-β-蕓香糖苷這一種花青素苷成分。在花被片上部未檢測到花青素苷的存在。在花被片下部,花青素苷從花被片發(fā)育第一時期(S1)到第三時期(S3)逐漸升高,在第四時期(S4)則開始下降。葉綠素主要積累在花被片早期(S1和S2時期)的上下部,而在發(fā)育后期(S3和S4時期)的花被片中含量逐漸降低。2.百合雙色花發(fā)育形成過程的轉(zhuǎn)錄組分析為了系統(tǒng)地研究不同發(fā)育時期百合雙色花花被片的時空轉(zhuǎn)錄組變化情況,我們對雙色花百合‘Tiny Padhye’的S2時期花被片的上下部以及對S1、S3和S4三個時期下部分別進行了轉(zhuǎn)錄組測序。共獲得713,120,548條高質(zhì)量序列,從頭組裝共獲得295,787條unigenes。KEGG分析表明,61個unigenes屬于了花青素苷合成基因;106個unigenes屬于葉綠素代謝通路結(jié)構(gòu)基因。進一步的差異基因表達(dá)分析表明,花青素苷合成基因在花被片下部特異協(xié)同表達(dá)導(dǎo)致花青素苷特異地積累于花被片下部,而在花被片上部不表達(dá)。百合花被片中葉綠素含量逐漸下降的原因為隨著花被片的發(fā)育,葉綠素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因在花被片上下部的表達(dá)量逐漸下降,而葉綠素降解相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量迅速上升。此外,通過WGCNA分析,參與調(diào)控百合花被片中花青素苷合成通路以及葉綠素代謝通路的候選轉(zhuǎn)錄因子也得以鑒定。3.百合雙色花花被片發(fā)育過程中qRT-PCR內(nèi)參基因的篩選qRT-PCR是一項廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)水平研究的技術(shù),該技術(shù)的準(zhǔn)確性依賴于穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。本研究中,10個植物中常用作內(nèi)參基因的持家基因被選為候選內(nèi)參基因。分別使用geNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder和比較ΔCt法評價了這些候選內(nèi)參基因在百合‘Tiny Padhye’不同發(fā)育時期花被片中以及不同試驗條件下的穩(wěn)定性。最終結(jié)果表明:在花被片不同發(fā)育時期中,TIP41和ACT為最適內(nèi)參組合;在花被片遮光處理中,TIP41和F-box為最佳內(nèi)參組合;在不同組織中,ACT、ACT11和EF1-α為最佳內(nèi)參組合;在所有樣品中,ACT、TIP41、ACT11為最佳內(nèi)參組合。使用穩(wěn)定性不同的內(nèi)參分別計算了兩個花青素苷合成相關(guān)基因LhF3′H和LhUFGT的表達(dá)水平,該結(jié)果進一步驗證了篩選到的最適內(nèi)參基因的可靠性。4.花青素糖基化基因Lh UFGT的克隆及功能研究克隆得到花青素糖基化關(guān)鍵基因LhUFGT基因,其開放閱讀框(ORF)為1371 bp,編碼456個氨基酸。系統(tǒng)進化分析表明,該基因編碼的氨基酸序列與已報道的3GTs蛋白聚在一起�；驎r空表達(dá)分析表明,該基因在S1時期花被片下部不表達(dá),而在S2和S3下部表達(dá)量最高,之后隨著花被片的發(fā)育表達(dá)量逐漸下降;該基因在各個發(fā)育時期的花被片上部表達(dá)量均很低。該基因的表達(dá)趨勢和花被片中花青素苷含量的變化趨勢較相似。通過同源重組的方法成功構(gòu)建含該基因ORF區(qū)的過表達(dá)載體pCAMBIA3301-Lh UFGT。該基因可以恢復(fù)3GT基因功能缺失的擬南芥突變體(ugt78d2)的表型。以上結(jié)果均表明LhUFGT蛋白具有3GTs家族成員的酶催功能。5.葉綠素降解基因Lh SGR的克隆及功能研究克隆得到葉綠素降解關(guān)鍵基因LhSGR基因,其開放閱讀框(ORF)為753 bp,編碼250個氨基酸。系統(tǒng)進化分析表明,該基因編碼的蛋白與已報道的單子葉植物SGRs蛋白聚在一起�；驎r空表達(dá)分析表明,該基因的表達(dá)趨勢和花被片中葉綠素含量的變化成負(fù)相關(guān),在花被片早期(S1和S2)表達(dá)量較低而在發(fā)育后期(S3和S4)含量較高。在煙草葉片中瞬時過表達(dá)該基因可以導(dǎo)致煙草葉片黃化。證明該基因參與百合花被片中葉綠素降解過程。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S682.29
【圖文】：

花青素的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)

2圖 1.2 花青素苷的生物合成途徑（Albert et al.，2011）Fig.1.2 Pathway of anthocyanin biosynthesis（Albert et al.，

圖 1.3 花青素苷合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Albert et al.，2014）Fig.1.3 Anthocyanin gene regulation network（Albert et al.，2014）研究發(fā)現(xiàn)，花青素苷激活因子 R2R3-MYBs 的時空表達(dá)受 HY5、NAC、SPL 和 LBD 等轉(zhuǎn)因子的調(diào)控。在強光條件下，擬南芥 NAC 轉(zhuǎn)錄因子 ANAC078 通過活化花青素苷生物合成相基因來誘導(dǎo)花青素苷的積累（Morishita et al.，2009）。擬南芥 HY5 可以直接結(jié)合到基因 PA

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本文編號：2792801