發(fā)布時間：2020-08-13 08:58

【摘要】：土壤鹽堿化是限制植物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的重要因素,是提高我國耕地生產(chǎn)效率的主要障礙之一。土壤日益嚴(yán)重的鹽堿化可對植物的生長發(fā)育造成離子毒害、滲透脅迫、氧化脅迫及高pH脅迫,篩選對鹽堿具有耐受性的作物品種是減少土壤鹽堿化導(dǎo)致產(chǎn)量損失的主要策略之一。大白菜是葉菜類中單位種植面積產(chǎn)量最高的蔬菜,富含豐富的維生素,是秋冬季最受歡迎的菜品。分離鑒定抗逆基因、進行大白菜耐逆育種,是今后有效利用鹽漬化土壤的主要途徑。大量研究表明,植物中的PPR基因可響應(yīng)鹽、干旱和ABA等多種逆境脅迫,但有關(guān)大白菜中PPR基因耐逆功能研究尚未見報道。本文以大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)的BrPPR基因為研究對象,利用野生型和BrPPR過表達擬南芥株系為實驗材料,對BrPPR基因的功能及耐堿等機制進行了探索,所得研究結(jié)果如下:1.BrPPR基因功能分析本實驗室早期從大白菜pol CMS恢復(fù)系中克隆、鑒定到一個對育性恢復(fù)過程十分重要的PPR基因(BrPPR),其蛋白產(chǎn)物定位在線粒體。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),BrPPR基因長1953 bp,不含任何內(nèi)含子,編碼一個含有650個氨基酸的PPR蛋白,由15個串聯(lián)的PPR基序構(gòu)成的P亞類PPR蛋白,該基因與油菜PPR基因的同源性最高。啟動子分析顯示,BrPPR啟動子區(qū)的HSE、LTR、MBS、TGA元件分別與熱、低溫、干旱和生長素脅迫的響應(yīng)有關(guān)。該基因的表達模式分析表明,其受堿和H2O2脅迫的誘導(dǎo),隨處理時間的延長,BrPPR基因在兩種逆境處理后的表達水平呈現(xiàn)先升高后降低。該基因的擬南芥過表達系對高pH、NaHCO3和H2O2脅迫均表現(xiàn)抗性,例如種子提前萌發(fā),萌發(fā)率提高,子葉提前張開,地上部分增大,根長增長,側(cè)根數(shù)增多等,而對照中二者無明顯差異。50 mM NaHCO3 土壤種植的擬南芥過表達系植株的成活率比野生型明顯提高。ROS染色實驗表明,過表達系在堿和H2O2脅迫下積累更少的ROS,細(xì)胞內(nèi)H2O2和氧化脅迫產(chǎn)物MDA的含量也顯著低于野生型,表明過表達系中所受到的氧化脅迫有所減弱;進一步分析發(fā)現(xiàn),過表達系中與ROS合成、清除和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達水平也比野生型低;對ROS清除相關(guān)抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX的活性也均低于野生型。添加GST處理可以消除過表達擬南芥與野生型本身積累的ROS及各種逆境下新產(chǎn)生ROS的差別,使其表型趨于一致。綜合以上結(jié)果表明:BrPP/R基因可能通過減少ROS生成和積累來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡,從而介導(dǎo)對堿脅迫的抗性。2.BrPPR作用機制分析線粒體是活性氧產(chǎn)生的重要場所之一,而電子傳遞鏈復(fù)合體I(NADH脫氫酶復(fù)合體)是其生成的主要部位,我們通過RT-RCR和qRT-PCR技術(shù)對復(fù)合體I的各亞基轉(zhuǎn)錄物及其剪接情況進行了測定,NaHC03和高pH處理分別導(dǎo)致野生型中nad2亞基第四個內(nèi)含子和nad7第四個內(nèi)含子剪接效率的下降;過表達系中nad2、nad7第四個內(nèi)含子剪接效率則明顯增強,而在正常條件下,野生型與過表達擬南芥中兩者并無明顯差異。對復(fù)合體I中NADH脫氫酶的活性進行了檢測,結(jié)果顯示,脅迫處理后過表達系中該酶活性顯著高于野生型。在正常情況下,若細(xì)胞色素C途徑的電子傳遞因故受阻,則交替氧化酶途徑將會補償性提高。我們測定了在堿脅迫下過表達系中AOX基因的表達明顯弱于野生型,說明過表達系的細(xì)胞色素C途徑的電子傳遞途徑效率高于野生型;堿脅迫對野生型電子傳遞鏈的破壞更嚴(yán)重,從而使其被動上調(diào)AOX基因的活性�？傊瓸rPPR基因可能通過促進電子傳遞鏈復(fù)合體I的剪接來維持線粒體電子傳遞的正常進行,減少ROS的產(chǎn)生,表現(xiàn)出耐堿性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S634.1
【圖文】：

邐｜逡逑Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ逡逑圖１－１．氋等植物線粒體呼吸電子傳遞鏈（ＲａｇｈａｖｅｎｄｒａａｎｄＰａｄｍａｓｒｅｅ，２００３）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ邋ｃｈａｉｎ邋ｉｎ邋ｈｉｇｈｅｒ邋ｐｌａｎｔｓ邋（Ｒａｇｈａｖｅｎｄｒａ逡逑ａｎｄ邋Ｐａｄｍａｓｒｅｅ，邋２００３）逡逑細(xì)胞色素氧化酶途徑的成分對氰化物敏感，電子傳遞容易被阻斷，此外，逡逑還存在另一條電子傳遞鏈邐交替氧化酶途徑（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ邋ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＯＸ），該逡逑途徑為植物細(xì)胞所特有，并能抗除氰化物的影響。ＡＯＸ位于線粒體內(nèi)膜，并朝逡逑向細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)一側(cè)，當(dāng)細(xì)胞色素途徑被阻斷，還原態(tài)輔酶Ｑ攜帶的電子的傳遞逡逑方向發(fā)生改變，ＡＯＸ直接接受４個２⒔郹埃不乖

本文編號：2791789