發(fā)布時間：2020-08-10 22:36

【摘要】：作為我國南方的主要栽培果樹之一,荔枝在果樹產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位。而荔枝上病蟲害的頻繁發(fā)生,給荔枝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展帶來嚴重的經(jīng)濟損失。然而,目前尚有許多病害的病原物尚不明確。通過對開放的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行挖掘和分析,本研究在荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了一種小環(huán)狀RNA分子,并對其分子生物學(xué)特征和發(fā)生分布情況進行了研究。主要結(jié)果如下:1.對NCBI上已經(jīng)公布的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析,在荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)4條拼接序列(transcriptome shotgun assembly, TSA)中可能包含小環(huán)狀RNA分子信息。進一步分析表明,該小環(huán)狀RNA分子序列可能是蘋果銹果類病毒屬的序列。利用蘋果銹果類病毒屬的通用引物擴增獲得200 bp的產(chǎn)物,所獲序列與原始TSA拼接序列完全一致,從而證明該環(huán)狀小RNA分子可能是一種類病毒的序列。2.設(shè)計背向引物,擴增獲得該類病毒的全長為304nt,并且包含在TSA序列GBRI01043443內(nèi)。序列多樣性分析發(fā)現(xiàn)該類病毒有6個位點的堿基差異,序列相對保守。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測為棒狀,符合馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科的二級結(jié)構(gòu)特征,且保守結(jié)構(gòu)域序列與蘋果銹果類病毒屬相似。因此,推測為該屬類病毒,并將其暫時命名為荔枝類病毒(lychee viroid-like RNA, LVd-like RNA)。3.利用連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳和雜交驗證LVd-like RNA的環(huán)狀分子特性,同時證實其分子大小介于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)和啤酒花矮化類病毒(hop stuntviroid,HSVd)之間,且更接近 HSVd。4.系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),LVd-like RNA屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科蘋果銹果類病毒屬,與葡萄潛隱類病毒(Grapevine latent viroid, GLVd)的親緣關(guān)系最近,其次是柑橘類病毒VI (Citrus viroid VI,CVd VI)。5.制備LVd-like RNA的全長探針,通過雜交檢測調(diào)查其發(fā)生分布情況。調(diào)查的146份樣品中,中國有71份樣品,其中54份為陽性樣品,陽性率達到76%;而在法國的75份樣品中,未檢測到陽性樣品。制備包含LVd-like RNA的表達載體的農(nóng)桿菌菌液和體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,用兩種方式接種常規(guī)草本和木本植物,并在接種后2～4個月內(nèi)進行分子生物學(xué)檢測,均未獲得陽性樣品。以上結(jié)果表明,目前LVd-like RNA僅能從中國荔枝資源圃中檢測到。6.以蘋果銹果類病毒屬的通用引物進行克隆PCR,測序后發(fā)現(xiàn)1個CVd VI克隆和7個柿子類病毒2 (Persimmon viroid 2, PVd 2)克隆,說明CVd VI和PVd 2也可能存在于荔枝樣品中。用15%的非變性PAGE凝膠電泳分離由上述通用引物擴增獲得的PCR產(chǎn)物,可以同時檢測到三種病原物的存在,從而建立了同時檢測CVdVI, PVd2和LVd-likeRNA的技術(shù)體系。在本研究中,通過分析TSA的序列和分子生物學(xué)特點證明小環(huán)狀RNA分子本質(zhì)是一種類病毒,命名為荔枝類病毒,同時發(fā)現(xiàn)CVd VI和PVd 2也可能存在于荔枝中,并建立了這三種病原物的檢測體系。荔枝類病毒的發(fā)現(xiàn)為類病毒的研究提供了新的資源,同時為荔枝的病害診斷和研究提供理論借鑒。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.67
【圖文】：

樹皮灰黑色�；ㄐ蝽斏�，闊大，多分枝；花梗纖細，長約２？４邋ｍｍ，有時粗而短；萼被金逡逑黃色短絨毛；雄蕊６？７個，有時８個，花絲長約４邋ｍｍ；子房密覆小瘤體和硬毛。果卵圓形或近逡逑球形，長２？３．５邋ｃｍ，成熟時通常為暗紅色至鮮紅色；種子全部被肉質(zhì)假種皮包裹（圖１－１），屬于逡逑非呼吸躍變型水果（Ａｋａｍｉｎｅ，邋１９７３）。逡逑’’姻逡逑圖ｉ－ｉ荔枝的各個組織形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ邋ｆｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｆ邋ｌｙｃｈｅｅ逡逑Ａ、Ｂ：荔枝花；Ｃ、Ｄ：荔枝果實；Ｅ：荔枝根莖部位；Ｆ：荔枝葉片；圖片來自中國植物志圖庫。逡逑１逡逑

１９７６年Ｓａｎｇｅｒ等人通過５％的ＰＡＧＥ檢測接種和未接種黃瓜白果類病毒（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ邋ｐａｌｅ邋ｆｒｕｉｔ逡逑ｖｉｒｏｉｄ，邋ＣＰＦＶｄ）的番茄葉片總ＲＮＡ，分離到類病毒的條帶，并通過目的條帶回收再接種，進一步逡逑證明了該類病毒是引起黃瓜上癥狀的病原物（Ｓａｎｇｅｒ，邋１９７６）（圖１－６）。同時利用超速離心的方法，逡逑分析不同類病毒的沉降系數(shù)，確定了邋ＣＰＦＶｄ邋（后來命名為Ｈｏｐｓｔｕｎｔｖｉｒｏｉｄ）的分子量為ｌ．ｌｘｌＯ５，逡逑相橘裂皮類病毒（Ｃｉｔｒｕｓ邋ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ邋ｖｉｒｏｉｄ，邋ＣＥＶｄ）的分子量為邋１．１９＞＜ｌ0５，ＰＳＴＶｄ邋的分子量為邋１．２７＞＜１0５。逡逑利用熱力學(xué)變性的方法證明類病毒具有很高的熱力學(xué)穩(wěn)定性，可以形成大量的堿基互補配對。在逡逑變性和非變性條件下類病毒分子的沉降系數(shù)變化證明了類病毒的單鏈ＲＮＡ分子特性。用摩擦系逡逑數(shù)計算沉降系數(shù)時，類病毒與轉(zhuǎn)運ＲＮＡ邋（ｔＲＮＡ）的比較，證明類病毒可以形成共價閉合環(huán)狀結(jié)逡逑構(gòu)，并在電子顯微鏡下觀察變性和未變性條件下類病毒的分子形態(tài)，進一步說明類病毒的單鏈環(huán)逡逑狀分子特性（Ｓａｎｇｅｒ，邋１９７６）（圖邋１－７）。逡逑６逡逑

邋２０１３；邋Ｗｕ，２０１２；邋Ｚｈａｎｇ，邋２０１４ｂ）。因此，類病毒的種類和數(shù)量在不斷增加。作為最小的病原物，逡逑類病毒既沒有蛋白質(zhì)的包被也沒有龐大的基因組，基因組僅由單鏈ＲＮＡ組成，且基因組大小在逡逑２４６？４０１邋ｎｔ之間，體現(xiàn)了生物進化過程中遺傳物質(zhì)的多樣性（圖１－８）。逡逑Ｉ邋＇邋ｉ，邋＾ｔｉｃｕｍ邋ａｅｓｔｆｖｕｍ邋一邋１６．０００．０００．０００邐■－象逡逑ｒ邐２．９00．000．00０—？？邋Ｈｏｍｏ邋ｓａｐｉｅｎｓ逡逑ｍｍ邐ｎ逡逑＾邐１邐灥}卞五危粒潁幔猓椋洌錚穡螅椋簀義希櫻幔悖悖瑁幔潁錚恚悖澹簀澹�，�(dān)埃埃埃埃板義希悖澹潁澹觶椋螅椋幔邋義希矗罰玻�，０００邋逦逦Ｅｓｃｈｅ}椋悖瑁椋徨澹悖錚歟戾義希郟潁海常校蓿殄巍觶齲殄義希馘危叔澹校瑁簦錚穡椋幔螅恚徨邋五危櫻歟輳眩眩彥義希叔五五五五五五義�？，邋／邋ｊ逦…？’＾辶x希椋椋椋ｅ逡弧瑰危哄義稀誨澹粒悖簦澹睿錚觶椋潁觶簀巍澹常擔(dān)剩場�？辶x希板蹇у澹櫻Γ隋義希儒危鄭椋潁錚歟溴義賢跡保富蜃櫬笮〉牡萁鄧承蟈義希疲椋紓澹保稿澹模澹螅悖澹睿洌椋睿玨澹螅悖幔歟邋澹錚駑澹紓澹睿錚恚椋沐澹螅椋邋義仙鮮齙幕蜃櫬笮〕死嗖《競褪刪逵茫遙危簾硎疽醞�，其余的基因组均用ＤＮ：燀时MＦ渲行÷蟮幕蜃槭且誨義細黿浦�。上蠟撮线分兵d硎鞠赴氬《局浜筒《居肜嗖《局淶慕縵擼ǎ攏錚潁澹�，邋２０１�(dān)�。辶x希桑茫裕值淖钚鹵ǜ嫦允荊徽矯睦嗖《局揮校常倉幀０湊綻嗖《鏡男蛄刑卣鰲⒍督峁瑰義喜鉅�、复制方g�、复制位置壹s霸誚械奈恢玫忍氐

本文編號：2788704