【摘要】：擴(kuò)張蛋白是一類植物細(xì)胞壁活性蛋白,普遍存在于在正在生長的組織和成熟的果實(shí)中。黃瓜擴(kuò)張蛋白基因CsEXP10基因來自于正在生長的黃瓜幼果,參與了黃瓜果實(shí)膨大生長過程。但該基因參與果實(shí)膨大生長進(jìn)程、促進(jìn)果實(shí)發(fā)育的作用機(jī)理目前還不明了。為了深入研究該基因的功能,本試驗(yàn)以“津優(yōu)1號”黃瓜子葉節(jié)為外植體,研究了苗態(tài)、乙酰丁香酮(AS)在預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)基中的濃度、無菌水脫菌次數(shù)和噻孢霉素(Cef)在選擇培養(yǎng)及生根培養(yǎng)基中的濃度對黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化的影響,優(yōu)化和建立了高效遺傳轉(zhuǎn)化體系;在此基礎(chǔ)之上,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法,將CsEXP10基因RNAi干擾載體成功導(dǎo)入黃瓜,獲得了轉(zhuǎn)基因植株,通過對轉(zhuǎn)基因植株的生理生化指標(biāo)測定,分析了干擾載體轉(zhuǎn)化對黃瓜植株生長發(fā)育的影響;研究了NaCl脅迫對轉(zhuǎn)基因黃瓜植株生長的影響,發(fā)現(xiàn)CsEXP10基因RNAi干擾載體的導(dǎo)入降低了黃瓜的耐鹽性。主要研究結(jié)果如下:1.黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。以“津優(yōu)1號”黃瓜為試驗(yàn)材料,從苗態(tài)、AS和Cef濃度、無菌水沖洗次數(shù)、生根培養(yǎng)等幾方面,優(yōu)化和建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明,取苗態(tài)為子葉抱合時的子葉節(jié),放置在預(yù)培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L6-BA+2.0 mg/L AgNO3+100μmol/L AS)中培養(yǎng)2 d,接著在共培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L6-BA+2.0 mg/L AgNO3+100μmol/L AS)中培養(yǎng)2 d,用無菌水沖洗3次,然后置于篩選培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3+300 mg/L Cef+100 mg/L Kan)上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng),不定芽長至2~3 cm時,切取不定芽放于生根培養(yǎng)基(MS+0.2 mg/L IAA+400mg/L Cef)上生根培養(yǎng)4 d,后轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基(MS+400 mg/L Cef)上繼續(xù)進(jìn)行生根培養(yǎng),可獲得較高的轉(zhuǎn)化率。2.CsEXP10基因RNAi干擾載體導(dǎo)入黃瓜。在建立和優(yōu)化黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)之上,進(jìn)行CsEXP10基因RNAi干擾載體的轉(zhuǎn)化,共得到了119棵抗性植株,存活下來34棵,經(jīng)過PCR檢測,最終得到了4株陽性轉(zhuǎn)基因苗,轉(zhuǎn)化率為11.76%。3.CsEXP10基因的功能。以非轉(zhuǎn)基因植株為對照,對轉(zhuǎn)基因植株的部分生長指標(biāo)進(jìn)行測定。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因植株的凈光合速率(Photo)、可溶性糖含量、過氧化物酶(POD)活性均明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株,而丙二醛(MDA)含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株;此外,轉(zhuǎn)基因植株的生長勢較弱,株高低于對照植株,幼果橫徑和縱莖小于對照植株,成熟果實(shí)瘦小畸形,而對照植株的果實(shí)長相周正,生長良好。這說明CsEXP10基因干擾載體的導(dǎo)入抑制了黃瓜植株的生長發(fā)育,該基因是黃瓜植株生長和果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因。4.鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的影響。以非轉(zhuǎn)基因植物為對照,研究了150 mmol/L氯化鈉(NaCl)溶液處理對轉(zhuǎn)基因黃瓜植株生長的影響。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株的Photo、氣孔導(dǎo)度(Cond)、胞間CO2濃度(Ci)及蒸騰速率(Trmmol)、葉綠素a、葉綠素b含量、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株,MDA含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株,而可溶性糖含量和POD活性與對照相比差異不顯著。鹽脅迫處理6 d后,所有黃瓜植株的葉片和莖部等部位逐漸變黃干枯,但轉(zhuǎn)基因植株首先出現(xiàn)干枯死亡,這說明CsEXP10基因RNAi干擾載體的導(dǎo)入顯著降低了黃瓜的耐鹽性。
【學(xué)位授予單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S642.2
【圖文】：

3）外植體的預(yù)培養(yǎng)外植體置于培養(yǎng)基表面，預(yù)培養(yǎng)（暗中）2 d。預(yù)培養(yǎng)基中添加不同濃為 0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L。3 24 個外植體。培養(yǎng)條件：溫度 25℃。20 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)目，愈傷性芽數(shù)統(tǒng)計(jì)方法見公式（2-1）、（2-2）。4）菌株活化、菌液制備和農(nóng)桿菌侵染圖 2-1 苗態(tài)類型A：子葉抱合；B：子葉微展開角度呈 30°左右；C：子葉半展開子葉展開角度較大呈 60°左右； D：子葉展平；Fig.2-1 Type of steriled seeding states of cucumberA: Closed cotyledon; B:Opening angle of cotyledon between 0~30 degree ;C: Opening angle of cotyledon between 30~60 degree; D: Flattened cotyledonA B C D

.7 黃瓜子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立本研究對外植體的苗態(tài)、預(yù)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)基中 AS 的添加濃度、無菌水沖洗培養(yǎng)基中 Cef 的添加濃度以及生根培養(yǎng)基成分進(jìn)行篩選優(yōu)化，我們最終確定了組合方案，即在無菌苗子葉抱合（苗態(tài)類型 A）時切取外植體，置于預(yù)培養(yǎng)基（M/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3+100 μmol/L AS）中培養(yǎng) 2 d，接著在共培養(yǎng)基（MS+2.0A+2.0 mg/L AgNO3+100 μmol/L AS）中培養(yǎng) 2 d，用無菌水沖洗 3 次，然后置于基（MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/LAgNO3+300 mg/L Cef+100 mg/L Kan）上進(jìn)行，不定芽長至 2~3 cm 時，切取不定芽放于生根培養(yǎng)基（MS+0.2 mg/L IAA+400圖 2-2 不同培養(yǎng)基成分對生根的影響A：不良根系；B：生根前的白色愈傷；C：良好根系Fig.2-2 The influence of different culture medium on rootingA: Bad roots; B:Callus ; C: Good rootsA B C

2.2.8 黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)的問題農(nóng)桿菌污染現(xiàn)象是以農(nóng)桿菌為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化過程中常見的問題，除此之外本研究發(fā)現(xiàn)，在黃瓜選擇培養(yǎng)及馴化移栽過程中我們發(fā)現(xiàn)了許多問題（見圖 2-4），在選擇培養(yǎng)過程中常會出現(xiàn)外植體愈傷組織生根的現(xiàn)象，影響了不定芽的分化，可能是選擇培養(yǎng)基的激素成分添加的比例失調(diào)造成的（圖 A）；在再生苗轉(zhuǎn)移無菌土中進(jìn)行馴化移栽過程中，第一次移栽后的前幾天是幼苗成活的關(guān)鍵時期，此階段特別容易出現(xiàn)爛根的現(xiàn)象（圖 B），造成移栽失��；馴化時植株容易發(fā)生雄花大量分化但雌花不分化的現(xiàn)象(圖圖 2-3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系A(chǔ)：無菌苗種子；B：無菌苗；C：外植體的預(yù)培養(yǎng)；D：共培養(yǎng)；E：選擇培養(yǎng)；F：生根培養(yǎng)；G—L：馴化及移栽Fig.2-3 Transfer by Agrobacterium mediation into Cotyledon nodes of cucumberA: Steriled seeds; B: Steriled seeding states; C: Pre-cultured of explants;D: Co-cultivation of explants;E: Select culture of explants; F: Rooting cultivation; G-L: Domestication and transplantingG H I J K L

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳家富;楊博文;向s慍

本文編號：2785860