【摘要】：梨的果實(shí)是一種具有經(jīng)濟(jì)價值的貯藏器官,果實(shí)中的糖是質(zhì)量和感官特性的主要決定因素。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sugar transporters,STs)在植物生長發(fā)育過程中有著重要的作用,主要介導(dǎo)糖類物質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn),參與源和庫組織之間的碳水化合物的裝載和卸載。糖在葉片的葉肉細(xì)胞中由光合作用生成,然后通過韌皮部運(yùn)輸?shù)綆炱鞴?如果實(shí)、種子、根和花。在長距離韌皮部運(yùn)輸后,糖從篩管分子-伴胞復(fù)合體(sieve element-companion cell,SE-CC)卸載到凋亡的外周細(xì)胞壁基質(zhì)中,而質(zhì)外體途徑通常與糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白偶聯(lián)以促進(jìn)糖通過膜的運(yùn)動。鑒定參與果實(shí)糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因并了解其分子調(diào)控機(jī)制,對提高梨感官品質(zhì)具有重要意義。本研究以三個砂梨品種‘翠冠’(Pyrus pyrifolia‘Cuiguan’)、‘黃花’(Pyrus pyrifolia‘Huanghua’)及‘圓黃’(Pyrus pyrifolia‘Wonhuwang’)為試材,研究砂梨果實(shí)發(fā)育過程中的幾種主要的可溶性糖含量的積累規(guī)律,通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從分子水平鑒定和篩選砂梨果實(shí)糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因,并對篩選的糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因使用實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證,同時將糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因的相對表達(dá)與糖水平進(jìn)行相關(guān)性分析。主要研究結(jié)果如下:1.隨著砂梨果實(shí)的發(fā)育,三個砂梨果實(shí)的總糖含量呈上升的趨勢。在果實(shí)生長初期總糖積累速率較慢,到果實(shí)生長中期總糖的積累速率最快,而在果實(shí)生長后期總糖的積累速率又減緩。成熟的果實(shí)在組成總糖的四種類型的糖中,果糖含量最高,其次為葡萄糖和山梨醇,蔗糖的含量最低。2.三個砂梨品種的果實(shí)發(fā)育過程中,幾種主要的可溶性糖的積累規(guī)律存在差異。三個砂梨品種果實(shí)中的山梨醇在果實(shí)發(fā)育早期迅速積累,果實(shí)發(fā)育中期積累速率有所減緩,到果實(shí)發(fā)育后期積累速率又稍有提高;三個砂梨品種中葡萄糖和果糖的積累規(guī)律相似,果實(shí)發(fā)育早期的積累速度較慢,中期積累速率明顯加快,后期積累速率呈緩慢趨勢,而‘翠冠’的果糖積累規(guī)律相比其他兩個品種有所差異,在中期積累速率加快,后期積累速率達(dá)到最快;三個砂梨品種的蔗糖積累規(guī)律一致,果實(shí)發(fā)育的前中期積累速率較慢,在果實(shí)發(fā)育后期積累速率達(dá)到最快。3.通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),共得到每個文庫含3.95×10~7~4.61×10~7個、大小為150 bp左右的雙端短序列(原始短序列);通過軟件對原始短序列過濾,每個文庫獲得高質(zhì)量短序列3.52×10~7~4.19×10~7個;高質(zhì)量短序列被比對到梨參考基因組,最終獲得42196個轉(zhuǎn)錄本,占模型基因總數(shù)的98.58%。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),通過進(jìn)化樹聚類分析,共鑒定出118個糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(STs),包括7個蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sucrose/H~+cotransporters或sucrose transporters,SUCs或SUTs),19個糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sugars will eventually be exported transporters,SWEETs),92個單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monosaccharide transporters,MSTs)。4.通過對高表達(dá)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)譜分析,在‘翠冠’的果實(shí)中表達(dá)總共30個ST基因,并且它們的表達(dá)譜可以分成三個主要簇。群集A由1個SWEET和9個MST組成,隨著果實(shí)的發(fā)育和成熟逐漸上調(diào)。具有1個SWEET和5個MST的群集B在所有果實(shí)發(fā)育階段被下調(diào),而群集C包括3個SUC和11個MST從花后25 d上調(diào)至花后55d,隨后隨著果實(shí)發(fā)育而下調(diào)。在‘圓黃’的果實(shí)中表達(dá)了32個ST,顯示出兩個主要的表達(dá)簇;群集A具有2個SUC,1個SWEET和9個MST,當(dāng)果實(shí)成熟時表現(xiàn)出上調(diào)的表達(dá),群集B由2個SUC,1個SWEET和17個MST組成,在果實(shí)發(fā)育期間下調(diào)。在‘黃花’中表達(dá)了32個ST,表現(xiàn)出兩個主要簇。具有2個SUC,1個SWEET和12個MST的群集A顯示出果實(shí)發(fā)育的上調(diào)表達(dá),而含有2個SUC和15個MST的群集B在果實(shí)發(fā)育期間下調(diào)。結(jié)合三個砂梨品種的表達(dá)譜,三個砂梨品種共有的高表達(dá)量基因有3個SUC和23個MST。用qRT-PCR驗(yàn)證篩選出11個基因,所有ST基因都顯示出與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相似的趨勢。除Pbr031281.1外的所有ST基因均具有顯著相關(guān)性(r5.0)。5.通過糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)與糖水平的相關(guān)性分析,我們發(fā)現(xiàn)有10個基因的相對表達(dá)量與可溶性糖(山梨醇、果糖、葡萄糖和蔗糖)的含量顯著相關(guān)。表明這些基因在糖的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要的作用,負(fù)責(zé)糖的轉(zhuǎn)入或轉(zhuǎn)出。這些ST基因可被認(rèn)為是參與山梨醇,蔗糖,己糖或戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)及其在砂梨果實(shí)中積累相關(guān)的的重要候選基因。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S661.2
【圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文糖中，果糖的含量最高，葡萄糖含量次之，而山梨醇和蔗糖品種之間，果實(shí)內(nèi)的葡萄糖和果糖含量相對穩(wěn)定，而山梨醇度比較大，進(jìn)而形成了梨果實(shí)不同糖酸風(fēng)味[37,47]。從淀粉的將前期看作是以積累淀粉為主，在果實(shí)生長后期則是由淀粉，是果實(shí)中糖含量的變化重要影響因素[48-49]。從果實(shí)的生長實(shí)生長初期，幼果期的果實(shí)內(nèi)部細(xì)胞分裂分化旺盛，需要通糖和山梨醇等分解單糖和磷酸化的葡萄糖合成相關(guān)的底物并理活動正常進(jìn)行。果實(shí)膨大期，細(xì)胞分裂分化減緩，主要是重迅速增加[50]，在這一時期多種可溶性糖不斷積累，多儲0-51]。在果實(shí)成熟期，果實(shí)中主要可溶性糖的含量達(dá)到最高，含量最高，其次為葡萄糖和蔗糖[52-53]。內(nèi)糖的運(yùn)輸

圖 1-2 梨果實(shí)細(xì)胞中糖代謝途徑(陳俊偉等，2004[31])Fig.1-2 Pathway of sugar metabolism in pear fruit cell（Chen et al.,2004[31]）形式通過山梨醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜進(jìn)入庫細(xì)胞，一部分儲存在液泡中，另一部分分解為果糖或葡萄糖。而在果實(shí)中，山梨醇的代謝途徑中受多種酶的參與和，其主要可以分為山梨醇合成酶類和山梨醇氧化酶類。山梨醇合成酶類主要梨醇-6-磷酸脫氫酶（sorbitol-6-phosphate dehydrogenase，S6PDH），葡萄糖-6酸在 S6PDH 的催化下可以轉(zhuǎn)化成山梨醇-6-磷酸，然后在磷酸酯酶（phosphorase）的作用下不可逆生成山梨醇。山梨醇氧化酶類主要包含山梨醇脫氫酶（+-sorbitol dehydrogenase，NAD+-SDH 和 NADP+-sorbitol dehydrogenase，NADDH）和山梨醇氧化酶（sorbital oxidase，SOX），其中 NAD+-SDH 催化山梨醇糖之間的相互轉(zhuǎn)化的可逆反應(yīng)，NADP+-SDH 催化山梨醇和葡萄糖之間的相互的可逆反應(yīng)，SOX 則可以催化山梨醇和氧氣的不可逆反應(yīng)生成葡萄糖。蔗糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶主要分為三類：蔗糖合成酶（sucrose synthase ，S化酶（invertase，Ivr）（分為酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase，AI）和中性轉(zhuǎn)化酶

速分離純化吹干，用 1.5 mL 雙蒸水溶解壁上的果渣，經(jīng)過 0.22 μm 的水化移入進(jìn)樣瓶，待高效液相色譜進(jìn)行檢測。3 個砂梨品種的每個時期樣品。PLC 條件溶性糖測定方法使用 HPLC 高效液相色譜法進(jìn)行，色譜條件參考 Koma方法進(jìn)行。色譜條件：以乙腈：水=8:2 為流動相，流速為 1.2 mL·min-1脫，柱溫為 40 ℃，以氮?dú)鉃檩d氣，40 P 流速，漂移管溫度為 65 ℃。驗(yàn)數(shù)據(jù)處理過標(biāo)準(zhǔn)品定性并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算每個樣品的峰面積，最后定量轉(zhuǎn)克鮮重樣品所含可溶性糖的毫克數(shù)（mg/g FW）。使用 EXCEL 2007 9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析。果與分析梨果實(shí)中的山梨醇的積累

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2779520