【摘要】：洋蔥(Allium cepa L.)在分類學(xué)上屬于天門冬目石蒜科蔥亞科蔥屬(APGIII)蔬菜作物,廣泛栽培于世界各地。因其基因組巨大(15,290 Mbp/C),分子生物學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究相對薄弱,主要集中在育性、顏色相關(guān)基因的分子標(biāo)記上,而關(guān)于洋蔥功能基因的研究甚少。果膠甲酯酶[pectin methylesterase,PME]是一類催化果膠復(fù)合物中甲酯化的D-半乳糖醛酸單元去甲酯化的一類細胞壁蛋白,根據(jù)其保守的結(jié)構(gòu)域該酶組成了一個巨大的基因家族,在植物不同的生長發(fā)育階段及其不同的生理過程中,通過作用于細胞壁而發(fā)揮作用。已有的研究發(fā)現(xiàn),果膠甲酯酶參與了多種生理過程,如果實成熟、器官脫落、小孢子發(fā)育和花粉管伸長、種子萌發(fā)、抗病性、形成層細胞分化等。本試驗在研究洋蔥育性相關(guān)基因差異表達的過程中,發(fā)現(xiàn)了一個大小約為350 bp的差異表達片段始終只在可育材料中出現(xiàn),克隆了其編碼序列。蛋白質(zhì)序列比對顯示,該基因表達的蛋白具有果膠甲酯酶結(jié)構(gòu)域,屬于果膠甲酯酶超家族成員。本研究以洋蔥育性恢復(fù)系12-10(S,MsMs)為研究材料,利用基因克隆、序列分析、原核表達、生物活性分析及基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮等方法,從分子生物學(xué)實驗層面初步證明了洋蔥AcPME基因是一個在洋蔥花粉發(fā)育過程中表達的具有PME蛋白活性的定位于細胞壁或細胞膜的PME蛋白超家族成員。本研究結(jié)果如下:(1)以洋蔥花蕾為試材,通過RACE實驗獲得了AcPME基因的表達序列;蛋白同源比對與系統(tǒng)進化分析表明,洋蔥PME蛋白與水稻、玉米、高粱等單子葉植物的同源蛋白具有較高的相似性;生物信息學(xué)分析表明,AcPME蛋白存在明顯的信號肽和跨膜區(qū)域(SP/TM)、PMEI結(jié)構(gòu)域和PME結(jié)構(gòu)域,在PME家族分類中屬于第一類,即含有一個長N末端前區(qū)域(pro-region);AcPME蛋白三維結(jié)構(gòu)模式圖顯示了該蛋白具有一個明顯的凹溝,4個結(jié)合位點氨基酸殘基(T423、Q453、R565和W567),2個活性位點氨基酸殘基(D476和D497)。(2)成功構(gòu)建了pGEX4T-1-PME和pET24a-PMEI原核表達載體,并在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中進行了表達條件的優(yōu)化,確定了pGEX4T-1-PME表達條件為17 oC,0.3 mM IPTG誘導(dǎo)4 h;pET24a-PMEI蛋白表達條件為37 oC,0.1 mM IPTG誘導(dǎo)4 h。SDS-PAGE電泳檢測明確了重組蛋白的存在形式,原核表達蛋白pGEX4T-1-PME為可溶性蛋白,而pET24a-PMEI蛋白則以包涵體形式存在;表達蛋白對應(yīng)的分子量分別約為61.73 kD和24.67 kD,與目的蛋白預(yù)期大小相符。(3)利用GST-tag純化柱對pGEX4T-1-PME表達產(chǎn)物純化了目的蛋白,同時利用His-tag純化柱采用柱上復(fù)性的方法純化了目的蛋白pET24a-PMEI,獲得了GST-PME和PMEI-6×His純化蛋白。(4)生物活性分析表明pGEX4T-1-PME(PME)具有明顯的PME活性;pET24a-PMEI(PMEI)能夠抑制自身蛋白PME的活性,而不能抑制外源蛋白P5400的活性。(5)利用pUC19載體和Ac GFP(Clontech)綠色熒光蛋白基因,成功構(gòu)建了pUC19-35S-AcPME-AcGFP亞細胞定位載體,并以pUC19-35S-AcGFP載體為陽性對照,利用基因槍轟擊洋蔥表皮方法進行亞細胞定位,在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)AcPME融合蛋白定位于細胞膜或細胞壁中,初步證明了該蛋白是一種作用于細胞膜或細胞壁蛋白。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S633.2

【參考文獻】

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