【摘要】：DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳機(jī)制,在不改變DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下調(diào)節(jié)基因的功能。植物中主要包括四種胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶:維持DNA甲基轉(zhuǎn)移酶METs家族、結(jié)構(gòu)域重組甲基化酶DRMs、染色質(zhì)甲基化酶CMTs與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt2家族�；ㄇ嘬帐撬{(lán)莓主要的代謝產(chǎn)物之一,具有重要的營(yíng)養(yǎng)和市場(chǎng)價(jià)值。目前有關(guān)藍(lán)莓花青苷研究主要集中在合成路徑調(diào)控與代謝、提取方法的改進(jìn)等,鮮有關(guān)于DNA甲基化和去甲基化基因?qū)ㄇ嘬丈锖铣傻挠绊憽１緦?shí)驗(yàn)選取南高叢藍(lán)莓品種'奧尼爾'和'藍(lán)雨'為研究試材,分離DNA甲基化、去甲基化以及花青苷合成相關(guān)基因,采用實(shí)時(shí)熒光定量法(qPCR)分析各基因在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)水平,通過比較轉(zhuǎn)色期前后花青苷含量差異,以及花青苷合成關(guān)鍵基因啟動(dòng)子中的甲基化變化,分析DNA甲基化和去甲基化基因?qū)ㄇ嘬丈锖铣煽赡艿挠绊憽＞唧w研究結(jié)果如下:(1)分別分離出藍(lán)莓DNA甲基化基因VcMET1、VcDRM2、VcCMT3和去甲基化基因VcDME1cDNA序列各一條。分析推導(dǎo)的氨基酸序列發(fā)現(xiàn),4個(gè)基因均包含植物中高度保守的結(jié)構(gòu)域:VcMETl包含2個(gè)N端調(diào)控區(qū)的復(fù)制叉作用位點(diǎn)DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域,2個(gè)參與DNA甲基化、復(fù)制與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的BAH及1個(gè)胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶Dcm結(jié)構(gòu)域;VcDRM2包含1個(gè)泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域UBA與1個(gè)S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域;VcCMT3分別包含1個(gè)BAH、Dcm及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾結(jié)構(gòu)域CHROMO;VcDMEI分別包含1個(gè)RRM_DME,一個(gè)編碼螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)的HHH super family以及一個(gè)可被Demeter-like蛋白探測(cè)的Perm-CXXC蛋白結(jié)構(gòu)域。qPCR分析發(fā)現(xiàn),VcMET1和VcCMT3隨著果實(shí)的發(fā)育表達(dá)量逐漸下降,在果實(shí)發(fā)育的后期甚至檢測(cè)不到;除在'藍(lán)雨' S6和S7期高表達(dá)外,VcDRM2在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期間mRNAs相對(duì)較低,且呈平緩下降狀態(tài);與DNA甲基化基因類似,去甲基化基因VcDME1在果實(shí)發(fā)育時(shí)期階段的表達(dá)也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。(2)根據(jù)報(bào)道的藍(lán)莓花青苷合成相關(guān)基因VcANS、FcDFR、VcCHS、VcF3H和VcUFGT基因序列,分離并研究這些基因在'奧尼爾'與‘藍(lán)雨'果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)模式上高度一致,呈現(xiàn)上升-下降-上升-下降的動(dòng)力學(xué)變化趨勢(shì)。(3)藍(lán)莓果實(shí)中花青苷主要積累在果皮,果實(shí)從S5期開始積累花青苷,隨后花青苷含量迅速增加;S5期果實(shí)呈白色或淺綠色,Br期1/4的藍(lán)莓果實(shí)呈淺紅或淺紫色,到S6期果實(shí)轉(zhuǎn)變成深藍(lán)色。pH示差法分析表明3個(gè)時(shí)期花青苷的含量分別是0.005、0.22和2.63 mg/g.FW。比較同時(shí)期花青苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)這些基因在花青苷積累之前表達(dá)豐度較高,花青苷的積累對(duì)其基因表達(dá)呈現(xiàn)反饋調(diào)控。(4)采用同源克隆法分離出'奧尼爾'與'藍(lán)雨'花青苷合成相關(guān)基因VcANS、VcDFR、VcCHS、VcF3HccUFGT啟動(dòng)子序列;利用啟動(dòng)子分析軟件PlantCARE預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),光響應(yīng)元件占40.30%,推測(cè)藍(lán)莓花青苷生物合成受光信號(hào)影響較大。(5)對(duì)花青苷合成相關(guān)基因VcANS和FcCHS啟動(dòng)子序列的胞嘧啶變化分析發(fā)現(xiàn),VcANS啟動(dòng)子從S5期-Br期-S6期中分別有2個(gè)、10個(gè)和8個(gè)胞嘧啶被甲基化,在轉(zhuǎn)色期前后僅在3個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(兩個(gè)TATA-box和一個(gè)CAAT-box)發(fā)生改變;VcCHS啟動(dòng)子從S5期-Br期-S6期中分別有2個(gè)、2個(gè)和4個(gè)胞嘧啶被甲基化;另外,VcANS和VcCHS啟動(dòng)子甲基化位點(diǎn)分別存在序列反義鏈上的CAAT-box區(qū)域和5'-UTR Py-rich stretch區(qū)域,屬于高轉(zhuǎn)錄水平的順式作用元件,影響花青苷相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),推測(cè)低甲基化狀態(tài)下的啟動(dòng)子序列促進(jìn)基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S663.9
【圖文】：

ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ）邋‘奧尼爾’與＇藍(lán)雨’果實(shí)，參考葉強(qiáng)對(duì)藍(lán)萄果實(shí)發(fā)育時(shí)期的分類，取逡逑特定時(shí)期樣品，每個(gè)時(shí)期采樣２０－５０個(gè)果實(shí)。以‘奧尼爾’為例，藍(lán)莓果實(shí)取樣時(shí)狀逡逑態(tài)參見圖２．１。其中，以藍(lán)莓花芽即將開放為鈴鐺花期為界限，即Ｓ０期，ＳＯ－Ｓ７表示逡逑藍(lán)莓果實(shí)發(fā)育后期，即果實(shí)發(fā)育各個(gè)時(shí)期。鈴鐺花期（Ｓ０）之前樣品需去除花瓣，僅逡逑保留子房和花托。Ｓ５期及以后的果實(shí)取回后，迅速用手術(shù)刀切成小塊。處理后的樣品逡逑經(jīng)液氮速凍后，凍存于－８０°Ｃ備用。逡逑圖２．１邋‘奧尼爾’藍(lán)莓果實(shí)發(fā)育過程中各時(shí)期取樣點(diǎn)逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅｓ邋ｏｆ邋Ｖ．邋ｃｏｒｙ＾ｍｂｏｓｕｍ邋（ｃｖ邋Ｏ＇Ｎｅａｌ）邋ｆｒｕｉｔｓ邋ｕｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ逡逑１．２載體與菌株逡逑實(shí)驗(yàn)采用載體為ＰＭＤ１９－Ｔ，菌株為大腸桿菌ＤＨ５ｃｔ，菌種由實(shí)驗(yàn)室保存。逡逑１．３試劑與儀器逡逑主要試劑有：２ｘｐＦｕ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；逡逑ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ？Ｉｓｔ邋Ｓｔｒａｎｄ邋ｃＤＮＡ邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋Ｋｉｔ、ｐＭＤｌ邋９－Ｔ邋ｖｅｃｔｏｒ、ＳＹＢＲ？Ｐｒｅｍｉｘ邋Ｅｘ邋Ｔａｑ？ＩＩ逡逑（ＴｌｉＲＮａｓｅＨ邋Ｐｌｕｓ）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；ＯＭＥＧＡ柱式ＤＮＡ膠回收試逡逑劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有

Ｆｉｇ．３．１邋Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｖａｒｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ．Ｌ邋＇Ｏ＇Ｎｅａｌ＇逡逑３．２邋ＲＮＡ質(zhì)量分析逡逑如圖３．２所示，采用ＣＴＡＢ－ＫＡｃ法提取‘奧尼爾’與‘藍(lán)雨’果實(shí)總ＲＮＡ。圖中逡逑２８Ｓ邋ｒＲＮＡ與１８Ｓ邋ｒＲＮＡ條帶清晰明亮，２８Ｓ邋ｒＲＮＡ條帶亮度在１８Ｓ邋ｒＲＮＡ的１．５－２．０倍逡逑之間，表明提取過程中ＲＮＡ幾乎未發(fā)生降解。兩種藍(lán)莓總ＲＮＡ如以２３0比值大于２．０，逡逑先６0／先８0比值在２．０左右，說(shuō)明ＲＮＡ無(wú)蛋白質(zhì)、酚類和多糖等污染。數(shù)據(jù)結(jié)果表明提逡逑取出的樣品總ＲＮＡ質(zhì)量良好，可進(jìn)行后續(xù)ｑＰＣＲ等分子操作。逡逑藍(lán)莓品種邐奧尼爾藍(lán)雨邐逡逑２８Ｓ邋ｒＲＮＡ邋—逡逑ｒＲＮＡ邋—逡逑圖３．２總ＲＮＡ提取逡逑Ｆｉｇ．３．２邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ逡逑３．３藍(lán)莓花青苷合成相關(guān)基因的分離逡逑通過普通邋ＰＣＲ，引物參考表邋３．１，利用邋ＮＣＢＩ邋數(shù)據(jù)庫(kù)（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）逡逑已經(jīng)發(fā)布的藍(lán)莓序列，從‘奧尼爾’葉片中分別成功分離出Ｋｄ、ＦｃＺ）尸ｉ？、ＦｃＣ／＾、逡逑ＦｃＦ３／／和ＦｃＪＴＦＧｒ。測(cè)序序列表明５個(gè)基因的開放閱讀框分別包含１，０７１邋ｂｐ，邋ｌ，０３８ｂｐ，逡逑１

圖３．２總ＲＮＡ提取逡逑Ｆｉｇ．３．２邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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