【摘要】：火龍果(Hylocereus undatus)是仙人掌科三角柱屬一種果用栽培品種,其外形獨(dú)特,果肉鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者喜愛,具有重大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)及商業(yè)價(jià)值。貴州精品水果建設(shè)已將火龍果列為第一重點(diǎn)支持產(chǎn)業(yè),然而受喀斯特山地生態(tài)環(huán)境的影響,火龍果在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)遭受干旱、高溫、鹽堿等各種逆境脅迫的影響,造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。轉(zhuǎn)錄因子是一種對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控起重要作用的蛋白分子,參與調(diào)控植物抗逆性、生長(zhǎng)發(fā)育等眾多生物學(xué)過程,bHLH轉(zhuǎn)錄因子是一類具有獨(dú)特HLH結(jié)構(gòu)域的蛋白家族,該類轉(zhuǎn)錄因子與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、色素合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、營(yíng)養(yǎng)吸收和逆境脅迫應(yīng)答等都有著密切的關(guān)系。目前,火龍果中尚無有關(guān)bHLH家族基因的研究報(bào)道,實(shí)驗(yàn)室前期成功構(gòu)建了抗旱相關(guān)基因富集的SSH-cDNA文庫(kù),篩選獲得一個(gè)在干旱脅迫下差異表達(dá)的火龍果bHLH轉(zhuǎn)錄因子EST片段,因此,在火龍果中開展bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因的研究,將豐富火龍果在逆境脅迫下的分子調(diào)控機(jī)理,特別是逆境脅迫下火龍果的抗逆轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制,為火龍果的抗逆分子育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。本文以生長(zhǎng)勢(shì)及抗逆性較強(qiáng)的火龍果品種“紫紅龍”為實(shí)驗(yàn)材料,克隆獲得了一個(gè)與逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子HubHLH1-like,并對(duì)它的序列特征、亞細(xì)胞定位、不同非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)模式進(jìn)行分析,進(jìn)而通過構(gòu)建基因過表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草初步進(jìn)行功能分析,主要研究結(jié)果如下:1.采用RT-PCR和RACE等技術(shù),克隆了火龍果“紫紅龍”bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的cDNA全長(zhǎng),命名HubHLH1-like。該基因全長(zhǎng)2,343 bp,開放閱讀框(ORF)1,221bp,編碼406個(gè)氨基酸,其編碼產(chǎn)物含有典型的HLH保守結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)分子量45.19 KD,理論等電點(diǎn)8.65。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明HubHLH1-like與其他高等植物bHLH蛋白具有較高的同源性,且在HLH功能結(jié)構(gòu)域上保守程度較高。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,HubHLH1-like與雙子葉被子植物可可堿性螺旋-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合蛋白(XP_007014952.1)同源性最高,親緣關(guān)系最近。2.通過構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pBWA(V)HS-HubHLH1-like-GFP,將目的基因與綠色熒光蛋白GFP融合,并采用PEG介導(dǎo)的電化學(xué)法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體,共培養(yǎng)后觀察目的基因的亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示HubHLH1-like定位在細(xì)胞核,具有核定位信號(hào),符合轉(zhuǎn)錄因子的特性。3.利用qPCR技術(shù)分析HubHLH1-like基因在不同逆境下的表達(dá),結(jié)果顯示,在干旱、高溫、低溫脅迫下,該基因上調(diào)表達(dá);在干旱脅迫5 d時(shí)表達(dá)量最高,10 d最低,干旱脅迫5 d時(shí)的表達(dá)量約為干旱脅迫10 d時(shí)的4倍,干旱脅迫20 d后該基因表達(dá)量仍處于較高水平。HubHLH1-like在高溫和低溫脅迫下上調(diào)表達(dá),同時(shí)其表達(dá)量受SA、ABA、H2O2的誘導(dǎo),且不同處理下該基因具有不同的表達(dá)模式,外源SA能夠增強(qiáng)該基因的表達(dá)。4.構(gòu)建了HubHLH1-like基因超表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將HubHLH1-like基因轉(zhuǎn)化模式植物煙草。經(jīng)過篩選與PCR分子檢測(cè),成功鑒定了10個(gè)能夠正常表達(dá)目的蛋白轉(zhuǎn)基因煙草株系,qPCR檢測(cè)結(jié)果表明,HubHLH1-like基因在10個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中,5號(hào)株系(Line-5)表達(dá)量最高,9號(hào)(Line-9)次之,3號(hào)株系(Line-3)表達(dá)量最低,研究結(jié)果為下一步功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2;S667.9
【圖文】：

2.3 結(jié)果與分析2.3.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)圖2-1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)A:總RNA；B:內(nèi)參基因Actin/PCR擴(kuò)增；M：DL2000Fig. 2-1 Quantification analysis of extracted total RNA and cDNAA: Total RNA; B: Amplification of Actin gene; M: DL2000高質(zhì)量的植物總RNA提取是基因全長(zhǎng)克隆成功的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)采用離心柱法提取火龍果幼嫩莖段總RNA，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，電泳結(jié)果（圖2-1，A）顯示RNA條帶無拖尾現(xiàn)象，18S和28S條帶清晰可見，并且28S條帶亮度約為18S的兩倍，說明提取的RNA質(zhì)量好

貴州大學(xué) 2017 屆碩士研究生學(xué)位論文23圖2-2 “紫紅龍”HubHLH1-like基因PCR擴(kuò)增注：1:HubHLH1-like 基因3’-RACE；2：HubHLH1-like基因5’-RACE；3：HubHLH1-like基因的ORF片段；M：DL 2000 markerFig. 2-2 Electrophoretogram of HubHLH1-like RACE PCR amplificationNote:PCR product showing the 3’-RACE (1), 5’-RACE (2), the ORF (3) of HubHLH1-like usingspecific primers；M, DL 2000 marker2.3.3 HubHLH1-like基因cDNA全長(zhǎng)及ORF的獲得將3’、5’-RACE所得到的基因片段序列與中間片段進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)2,343bp的HubHLH1-like基因cDNA序列，利用ORF Finder對(duì)拼接的全長(zhǎng)進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)，獲得HubHLH1-like基因的開放閱讀框大小為1,221 bp，共編碼406個(gè)氨基酸，非翻譯區(qū)5’-UTR大小235 bp，非翻譯區(qū)3’-UTR大小為887 bp，用Primer Premier5.0在開放閱讀框兩端設(shè)計(jì)引物HubHLH1-like-Full-F和HubHLH1-like-Full-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增

圖 2-3 HubHLH1-like cDNA 序列及其推測(cè)的氨基酸序列Fig. 2-3 The complete cDNA sequence and amino acids sequences of the proteinencoded by HubHLH1-like注：紅色劃線部分代表 HLH 結(jié)構(gòu)域；紅色方框?yàn)槠鹗济艽a子，星號(hào)代表終止密碼子。Note: The amino acid sequence is displayed in a one-letter code under the coding sequence,with the underlined amino acids in red representing the HLH domain. The translation start codonis framed, the asterisk denotes the stop codon.2.3.4 HubHLH1-like的生物信息學(xué)分析2.3.4.1 HubHLH1-like蛋白結(jié)構(gòu)域與氨基酸序列比對(duì)分析使用NCBI的CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)“紫紅龍”HubHLH1-like全長(zhǎng)序列中可能存在的蛋白結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明HubHLH1-like蛋白在340aa-389aa位有一個(gè)HLH保守結(jié)構(gòu)域，且HLH區(qū)域位于C末端，可參與形成同型或異型二聚體，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。通過GenBank accession數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbLnlm.nih.gov/Genbank/update.html)進(jìn)行登錄，命名HubHLH1-like，獲得基因登錄號(hào)：KU976397.1。

【參考文獻(xiàn)】

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1 葛菲;聶瓊;喬光;張婷;吳艷;文曉鵬;;轉(zhuǎn)火龍果過氧化氫酶基因煙草植株的獲得及其抗旱性分析[J];西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2016年11期

2 劉鵬飛;喬光;劉濤;彭志軍;蔡永強(qiáng);文曉鵬;;火龍果MSAP體系的優(yōu)化及組培苗DNA甲基化檢測(cè)[J];西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2016年09期

3 劉鵬飛;喬光;文曉鵬;;火龍果組培苗DNA甲基化變化及應(yīng)答赤霉素效應(yīng)[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2016年05期

4 王翠;蘭海燕;;植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的功能研究進(jìn)展[J];生命科學(xué)研究;2016年04期

5 郭創(chuàng);王翔;曹云;王靜軒;李璐;姜玉梅;尹鈞;;小麥轉(zhuǎn)錄因子TabHLH041基因的克隆與表達(dá)分析[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);2016年07期

6 張騰國(guó);毛玉珊;常燕;王娟;聶亭亭;;油菜ICE1基因表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草[J];蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2016年02期

7 何潔;顧秀容;魏春華;楊小振;李好;馬建祥;張勇;楊建強(qiáng);張顯;;西瓜bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因的鑒定及其在非生物脅迫下的表達(dá)分析[J];園藝學(xué)報(bào);2016年02期

8 REN Yiran;ZHAO Qiang;ZHAO Xianyan;HAO Yujin;YOU Chunxiang;;Expression Analysis of the MdCIbHLH1 Gene in Apple Flower Buds and Seeds in the Process of Dormancy[J];Horticultural Plant Journal;2016年02期

9 周良云;劉談;王升;唐金富;康利平;郭蘭萍;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究進(jìn)展及其在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用[J];中國(guó)現(xiàn)代中藥;2016年02期

10 周婧;高飛;張潤(rùn)敏;雒曉鵬;黃云吉;李成磊;吳琦;;苦蕎轉(zhuǎn)錄因子基因FtbHLH4的克隆及其對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答[J];西北植物學(xué)報(bào);2015年12期

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2 馮曉明;蘋果bHLH基因MdCIbHLH1克隆及功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

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2 趙民;菊花轉(zhuǎn)錄因子CmbHLH1的克隆及功能鑒定[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2778510