【摘要】：姜(Zingiber officainale Rosc.)屬多年生單子葉草本植物,它在植物分類(lèi)學(xué)上屬于姜科(Zingiberaceae),姜屬(Zingiber Mill.),是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。姜不開(kāi)花或很少開(kāi)花,栽培上長(zhǎng)期采用無(wú)性繁殖,致使種姜體內(nèi)含有多種病菌和病毒,而病毒的感染造成姜的產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。檢測(cè)分析小黃姜未知病毒,對(duì)小黃姜的病毒防治有一定理論意義。鑒于此,本研究利用sRNA高通量深度測(cè)序技術(shù)檢測(cè)分析了貴州省六盤(pán)水六枝特區(qū)折溪小黃姜病毒。并對(duì)該病毒的分子生物學(xué)特性進(jìn)行了初步探究。所獲研究結(jié)果如下:1.本研究利用sRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)貴州省六盤(pán)水市折溪鄉(xiāng)的小黃姜進(jìn)行了病毒預(yù)測(cè),通過(guò)contigs拼接與病毒蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),發(fā)現(xiàn)小黃姜中存在一個(gè)桿狀DNA病毒(badnavirus)屬的新成員,該病毒侵染我國(guó)小黃姜是國(guó)內(nèi)的首次報(bào)道。2.貴州省六盤(pán)水市折溪鄉(xiāng)的小黃姜存在桿狀DNA病毒屬的新病毒。1)使用Badnavirus的簡(jiǎn)并引物從小黃姜樣品中擴(kuò)增獲得6條RT/RNase H基因序列,與已報(bào)到的Badnavirus相應(yīng)序列的相似性均低于74%,根據(jù)目前的國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(the international committee on taxonomy of viruses,ICTV)病毒分類(lèi)方案,Badnavirus病毒中RT和RNase H核苷酸基序相似度低于80%的可劃為不同病毒種,從小黃姜中克隆出的病毒可能是Badnavirus中的一種新病毒,暫時(shí)命名為小黃姜桿狀病毒(Zingiber bacilliform virus,ZBV)。與21個(gè)Badnavirus不同成員病毒構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)樹(shù),結(jié)果表明,擴(kuò)增的6個(gè)分離物內(nèi)存在3種Badnavirus新病毒。2)小黃姜桿狀病毒的基因組為雙鏈環(huán)狀DNA,參考基因組長(zhǎng)5564 bp,對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明該序列存在多個(gè)Badnavirus成員的保守結(jié)構(gòu)域。但沒(méi)有普遍Badnavirus的ORF1與ORF2,該病毒基因組可能在進(jìn)化中被刪除一個(gè)片段。在自然界中,病毒是所有生物中具有最快的變異速度,通過(guò)片段的刪除或插入等方式獲得新的基因組順序排列,以增加對(duì)寄主的適合度。研究結(jié)果表明小黃姜桿狀病毒在進(jìn)化過(guò)程中存在復(fù)雜的多態(tài)性。3.利用自己編寫(xiě)的Perl語(yǔ)言腳本分析了ZBV來(lái)源的sRNA在小黃姜桿狀病毒參考基因組上的熱點(diǎn)分布。結(jié)果顯示,ZBV衍生的s RNA序列主要來(lái)源于正義鏈,以21 nt、22nt和24 nt大小為主,其中24 nt的sRNA數(shù)量最多,推測(cè)小黃姜在防御病毒侵染的過(guò)程中DCL3起到了主要作用。4.利用通用引物BadnaFP/BadnaRP對(duì)采自貴州省六盤(pán)水六枝特區(qū)折溪鄉(xiāng)的30株小黃姜和20份5個(gè)地區(qū)的黃姜塊莖進(jìn)行桿狀病毒PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)所有樣品中均擴(kuò)增得到目的片段大小的產(chǎn)物,病毒檢出率為100%。對(duì)實(shí)驗(yàn)室中的折溪小黃姜脫毒無(wú)菌苗進(jìn)行ZBV病毒檢測(cè),結(jié)果呈樣性,表明該病毒部分基因組或者全部基因組已經(jīng)整合入小黃姜基因組中。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S436.32
【圖文】：

圖 1.3 Badnavirus 在世界范圍內(nèi)的分布（Bhat et al., 2016）Fig 1.3 Worldwide distribution of badnavirus3.2 桿狀 DNA 病毒的形態(tài)學(xué)Badnavirus 的病毒粒子呈桿菌狀，兩端圓滑，側(cè)邊平行，無(wú)包膜，直徑為 30nm，長(zhǎng)度一般在 60  900 nm 之間，大多數(shù)為 130 nm，衣殼上無(wú)突起及其它外殼表面結(jié)構(gòu)。該屬大多數(shù)種的病毒粒子存在于寄主植物的細(xì)胞質(zhì)中，單個(gè)或成群不規(guī)則分布，粒子分散或者排列成柵欄狀，不在內(nèi)含體或有膜囊泡結(jié)構(gòu)中（洪健等， 2001）。3.3 桿狀 DNA 病毒的分子生物學(xué)特性桿狀 DNA 病毒的核酸為單分子開(kāi)環(huán)狀雙鏈 DNA（Double stranded DNA,dsDNA），雙鏈的每一條鏈上的特定位點(diǎn)都有一個(gè)帶單鏈序列的缺口，基因組長(zhǎng)

RNA 為核糖體 RNA（ribosome, rRNA），電泳后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)可觀察到明顯的 rRNA 條帶。28s rRNA 和 18s rRNA 大小分別為 5 kb 和 2 kb 左右，且植物樣品中最大 rRNA 亮度為次大 rRNA 亮度的 2 倍，否則表示 RNA 樣品被降解。完整未降解的植物 rRNA 樣品應(yīng)看到 28s rRNA、18s rRNA 和 5sRNA 這三條帶，頂端的條帶亮度為第二條條帶的 2 倍，若出現(xiàn)彌散片裝和條帶消失說(shuō)明樣品已降解。2.2 sRNA 深度測(cè)序sRNA 深度測(cè)序樣品送至深圳華大基因研究院建庫(kù)測(cè)序，使用 NEB 針對(duì)Illumina 測(cè)序平臺(tái)研發(fā)的 Small RNA 建庫(kù)試劑盒及配套試劑進(jìn)行小 RNA 文庫(kù)構(gòu)建，庫(kù)檢合格的小 RNA 文庫(kù)加載到測(cè)序芯片 flowcell 上，在 Illumina-HiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行 1 - 50bp 單端測(cè)序，流程圖見(jiàn)圖 1.4。

結(jié)果圖 2.1），OD260/OD28 sRNA 測(cè)序要求。sR去除低質(zhì)量序列后，ds，長(zhǎng)度分布介于 18 920 條 18  30 nt 的小NA 序列做長(zhǎng)度分布統(tǒng)25 nt（圖 2.2）。長(zhǎng)度分于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析及實(shí)驗(yàn)

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭寬瑜;董家紅;方琦;李婷婷;尹躍艷;張仲凱;;膠體金免疫電鏡技術(shù)檢測(cè)番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒[J];電子顯微學(xué)報(bào);2015年01期

2 張瑩;洪濤;宋敬東;何金生;;電子顯微鏡技術(shù)—病毒結(jié)構(gòu)與形態(tài)研究及快速診斷的基礎(chǔ)平臺(tái)[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2013年09期

3 吳麗婷;阮小蕾;沈文錦;譚小勇;翟國(guó)會(huì);李華平;;菠蘿桿狀DNA病毒的全基因組序列測(cè)定及分析[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年09期

4 陳秀;阮小蕾;趙芹;李華平;;富貴竹中桿狀DNA病毒湖北分離物的分子鑒定[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年06期

5 劉振偉;植物脫毒技術(shù)[J];中國(guó)果菜;2005年01期

6 覃瑞,程旺元;黃瓜花葉病毒研究進(jìn)展[J];中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年02期

7 袁小環(huán),李青;血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法檢測(cè)植物病毒研究進(jìn)展[J];熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué);2001年06期

8 楊崇良;植物病毒研究及進(jìn)展[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2000年06期

9 徐坤,楊俊華;脫毒生姜及高產(chǎn)栽培技術(shù)[J];長(zhǎng)江蔬菜;2000年08期

10 施曼玲,周雪平;植物病毒病的診斷技術(shù)[J];微生物學(xué)通報(bào);2000年02期

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本文編號(hào)：2767632