【摘要】：姜(Zingiber officainale Rosc.)屬多年生單子葉草本植物,它在植物分類學(xué)上屬于姜科(Zingiberaceae),姜屬(Zingiber Mill.),是我國重要的經(jīng)濟作物。姜不開花或很少開花,栽培上長期采用無性繁殖,致使種姜體內(nèi)含有多種病菌和病毒,而病毒的感染造成姜的產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。檢測分析小黃姜未知病毒,對小黃姜的病毒防治有一定理論意義。鑒于此,本研究利用sRNA高通量深度測序技術(shù)檢測分析了貴州省六盤水六枝特區(qū)折溪小黃姜病毒。并對該病毒的分子生物學(xué)特性進行了初步探究。所獲研究結(jié)果如下:1.本研究利用sRNA高通量測序技術(shù)對貴州省六盤水市折溪鄉(xiāng)的小黃姜進行了病毒預(yù)測,通過contigs拼接與病毒蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和核苷酸數(shù)據(jù)庫比對,發(fā)現(xiàn)小黃姜中存在一個桿狀DNA病毒(badnavirus)屬的新成員,該病毒侵染我國小黃姜是國內(nèi)的首次報道。2.貴州省六盤水市折溪鄉(xiāng)的小黃姜存在桿狀DNA病毒屬的新病毒。1)使用Badnavirus的簡并引物從小黃姜樣品中擴增獲得6條RT/RNase H基因序列,與已報到的Badnavirus相應(yīng)序列的相似性均低于74%,根據(jù)目前的國際病毒分類委員會(the international committee on taxonomy of viruses,ICTV)病毒分類方案,Badnavirus病毒中RT和RNase H核苷酸基序相似度低于80%的可劃為不同病毒種,從小黃姜中克隆出的病毒可能是Badnavirus中的一種新病毒,暫時命名為小黃姜桿狀病毒(Zingiber bacilliform virus,ZBV)。與21個Badnavirus不同成員病毒構(gòu)建系統(tǒng)進樹,結(jié)果表明,擴增的6個分離物內(nèi)存在3種Badnavirus新病毒。2)小黃姜桿狀病毒的基因組為雙鏈環(huán)狀DNA,參考基因組長5564 bp,對序列進行生物信息學(xué)分析表明該序列存在多個Badnavirus成員的保守結(jié)構(gòu)域。但沒有普遍Badnavirus的ORF1與ORF2,該病毒基因組可能在進化中被刪除一個片段。在自然界中,病毒是所有生物中具有最快的變異速度,通過片段的刪除或插入等方式獲得新的基因組順序排列,以增加對寄主的適合度。研究結(jié)果表明小黃姜桿狀病毒在進化過程中存在復(fù)雜的多態(tài)性。3.利用自己編寫的Perl語言腳本分析了ZBV來源的sRNA在小黃姜桿狀病毒參考基因組上的熱點分布。結(jié)果顯示,ZBV衍生的s RNA序列主要來源于正義鏈,以21 nt、22nt和24 nt大小為主,其中24 nt的sRNA數(shù)量最多,推測小黃姜在防御病毒侵染的過程中DCL3起到了主要作用。4.利用通用引物BadnaFP/BadnaRP對采自貴州省六盤水六枝特區(qū)折溪鄉(xiāng)的30株小黃姜和20份5個地區(qū)的黃姜塊莖進行桿狀病毒PCR檢測,發(fā)現(xiàn)所有樣品中均擴增得到目的片段大小的產(chǎn)物,病毒檢出率為100%。對實驗室中的折溪小黃姜脫毒無菌苗進行ZBV病毒檢測,結(jié)果呈樣性,表明該病毒部分基因組或者全部基因組已經(jīng)整合入小黃姜基因組中。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.32
【圖文】：

圖 1.3 Badnavirus 在世界范圍內(nèi)的分布（Bhat et al., 2016）Fig 1.3 Worldwide distribution of badnavirus3.2 桿狀 DNA 病毒的形態(tài)學(xué)Badnavirus 的病毒粒子呈桿菌狀，兩端圓滑，側(cè)邊平行，無包膜，直徑為 30nm，長度一般在 60  900 nm 之間，大多數(shù)為 130 nm，衣殼上無突起及其它外殼表面結(jié)構(gòu)。該屬大多數(shù)種的病毒粒子存在于寄主植物的細胞質(zhì)中，單個或成群不規(guī)則分布，粒子分散或者排列成柵欄狀，不在內(nèi)含體或有膜囊泡結(jié)構(gòu)中（洪健等， 2001）。3.3 桿狀 DNA 病毒的分子生物學(xué)特性桿狀 DNA 病毒的核酸為單分子開環(huán)狀雙鏈 DNA（Double stranded DNA,dsDNA），雙鏈的每一條鏈上的特定位點都有一個帶單鏈序列的缺口，基因組長

RNA 為核糖體 RNA（ribosome, rRNA），電泳后通過凝膠成像系統(tǒng)可觀察到明顯的 rRNA 條帶。28s rRNA 和 18s rRNA 大小分別為 5 kb 和 2 kb 左右，且植物樣品中最大 rRNA 亮度為次大 rRNA 亮度的 2 倍，否則表示 RNA 樣品被降解。完整未降解的植物 rRNA 樣品應(yīng)看到 28s rRNA、18s rRNA 和 5sRNA 這三條帶，頂端的條帶亮度為第二條條帶的 2 倍，若出現(xiàn)彌散片裝和條帶消失說明樣品已降解。2.2 sRNA 深度測序sRNA 深度測序樣品送至深圳華大基因研究院建庫測序，使用 NEB 針對Illumina 測序平臺研發(fā)的 Small RNA 建庫試劑盒及配套試劑進行小 RNA 文庫構(gòu)建，庫檢合格的小 RNA 文庫加載到測序芯片 flowcell 上，在 Illumina-HiSeq測序平臺上進行 1 - 50bp 單端測序，流程圖見圖 1.4。

結(jié)果圖 2.1），OD260/OD28 sRNA 測序要求。sR去除低質(zhì)量序列后，ds，長度分布介于 18 920 條 18  30 nt 的小NA 序列做長度分布統(tǒng)25 nt（圖 2.2）。長度分于后續(xù)實驗分析及實驗

【參考文獻】

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本文編號：2767632