【摘要】：尖孢鐮刀菌蓮�；�(Fusarium oxysporum f.sp.nelumbicola)引起的蓮腐敗病是對(duì)蓮產(chǎn)業(yè)威脅最大的一種毀滅性病害。蓮腐敗病菌從受傷的根莖侵入,通過蓮維管束向上部和葉部蔓延,堵塞木質(zhì)部導(dǎo)管。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)是植物病原菌最重要的致病因子之一,在病原菌侵染寄主引起病害過程中起著關(guān)鍵作用。課題組前期證實(shí)蓮腐敗病菌侵染致病過程中能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶,其中PG活性最高。從蓮腐敗病菌中克隆獲得了6個(gè)PG基因,其中3個(gè)基因pg1、pg5和pgb在病原菌侵染48 h后誘導(dǎo)表達(dá)量最高。本論文通過真核表達(dá)、亞細(xì)胞定位、基因敲除等技術(shù)進(jìn)一步從分子和細(xì)胞水平分析這3個(gè)PG基因在病原菌致病過程中的作用。1.通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了3個(gè)PG同工酶的真核表達(dá)載體,利用甲醇誘導(dǎo)分泌出胞外蛋白PG1、PG5和PGb,分子量大小分別為38 KDa、37 KDa和53 KDa,與之前預(yù)測(cè)的分子量大小一致。重組蛋白pPICZαA-pg1在30-60℃之間活性較高,最適溫度為40℃,活性3.268 U/mg,在pH9.0時(shí)活性最高;重組蛋白pPICZαA-pg5在50℃時(shí)活性最高,為3.028 U/mg,最適pH6.0;重組蛋白pPICZαA-pgb最適溫度為50℃,最適pH10.0。2.用真核體外表達(dá)重組蛋白pPICZαA-pg1、pPICZαA-pg5和pPICZαA-pgb分別對(duì)白蓮蓮鞭進(jìn)行注射接種。接種1 d后,分別接種3個(gè)重組蛋白pPICZαA-pg1、pPICZαA-pg5和pPICZαA-pgb的白蓮處理均顯著發(fā)病,表現(xiàn)為葉片從葉緣處緩慢向葉中間萎蔫,為典型的蓮腐敗病菌致病癥狀。接種重組蛋白pPICZαA-pg1和pPICZαA-pgb的蓮植株在接種4 d后基本整株枯萎死亡。接種pPICZαA-pg5的蓮植株則在7 d后基本整株枯萎死亡。石蠟切片觀察發(fā)病和健康植株葉片和蓮鞭細(xì)胞壁,發(fā)現(xiàn)發(fā)病葉片細(xì)胞的細(xì)胞壁發(fā)生嚴(yán)重的降解,組織間隙離析,細(xì)胞呈松散狀。3.采用Gateway克隆等技術(shù)構(gòu)建了定位表達(dá)載體pCNH1-eGFP-pg1、pCNH1-eGFP-pg5和pCNH1-eGFP-pgb,通過注射浸潤(rùn)法將農(nóng)桿菌導(dǎo)入本氏煙瞬時(shí)表達(dá),利用激光共聚焦顯微鏡觀察在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。3個(gè)融合蛋白都主要定位于植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),此外,還發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)pCNH1-eGFP-pgb融合蛋白也有明顯的熒光信號(hào),說明PGb還能作用于寄主細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。4.通過同源重組的方法構(gòu)建了pg1、pg5和pgb的基因敲除載體,并利用ATMT的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化F23a,成功獲得了△pg1、△pg5、△pgb單基因缺失突變體。將各突變體接種蓮進(jìn)行致病性測(cè)定。一個(gè)月后,對(duì)照組植株全部發(fā)病枯萎死亡,突變體F23a△pg1發(fā)病顯著比野生型輕,表現(xiàn)為葉片從葉緣處向葉中間蜷曲萎蔫,未整株枯死;突變體F23a△pg5發(fā)病較突變體F23a△pg1重;突變體F23a△pgb發(fā)病最重,與野生型沒有顯著差異。說明pg1敲除后,蓮腐敗病菌致病力顯著下降,pg1在蓮腐敗病菌侵染過程中起著主要作用,而pg5和pgb基因敲除后,其侵染致病能力沒有顯著下降,說明該基因功能可能被其他基因功能互補(bǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S436.45
【圖文】：

敗病菌 PG1、PG5 和 PGB 同工酶 cDNA 的全長(zhǎng) Xho I 和 Not I 酶切位點(diǎn)的特異性引物。通過 P I 酶切位點(diǎn)的各目的基因片段。PCR 產(chǎn)物通過 1%分別克隆到 PMD18-T 載體上，獲得重組質(zhì)D18-T-pgb，送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，pg1列為 1074 bp，pgb 編碼區(qū)序列為 1434 bp，與原和 Not I 酶分別對(duì)重組質(zhì)粒 PMD18-T-pg1梭載體 pPICZαA 進(jìn)行雙酶切。結(jié)果可見，重組條 3000 bp 和一條 1000 bp 左右的條帶，其中 ，而 1000 bp 左右的條帶是 pg1 編碼區(qū)序列（切后，也切出一條3000 bp 和1000 bp 左右的條碼區(qū)序列（1074 bp）。PMD18-T-pgb 雙酶切后，切帶，其中 1500 bp 左右的條帶是 pgb 編碼區(qū)序列片段約為 3600 bp（圖 2.1）。

蓮腐敗病菌三個(gè) PG 基因真核表達(dá)及功能分析轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α中擴(kuò)繁，分別挑選 2-3 個(gè)單菌落進(jìn)行 PCR 鑒定篩選陽性重。由圖 2.2 可知，pPICZαA-pg1 的 1、2 號(hào)單菌落在預(yù)測(cè)的 1 500bp 位置有條帶CZαA-pg5 的 1、2 號(hào)單菌落在預(yù)測(cè)的 1 500bp 位置有條帶，pPICZαA-pgb 的 3 個(gè)落在預(yù)測(cè)的 2 000bp 位置均有條帶。挑選較好的條帶對(duì)應(yīng)的菌液送公司測(cè)序。測(cè)果顯示為目的基因的菌液確定為陽性重組子。菌液離心棄去上清，沉淀用 20%油保存置于-80℃冰箱中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ICZαA-pg1、pPICZαA-pg5 和 pPICZαA-pgb 陽engtification of cloning vector of pPICZαA-pg1pPICZαA-pgbM：DNAMarker；1-3：?jiǎn)尉?PCR 產(chǎn)物 Marker, one to three were PCR products of sinb 三個(gè)基因的真核表達(dá) pPICZαA-pg1，pPICZαA-pg5 和 pPICZ內(nèi)切酶 SacI 單酶切進(jìn)行線性化反應(yīng)。由圖小相一致，表明均酶切成功。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2764390