【摘要】：根據(jù)果肉質(zhì)地的不同將桃分為溶質(zhì)型(Melting flesh,MF)、不溶質(zhì)型(Non-melting flesh,NMF)和硬質(zhì)型(Stony hard,SH)三種類型。溶質(zhì)型桃果實(shí)在成熟過程中生長素和乙烯均發(fā)生躍變,果實(shí)迅速變軟,不耐儲(chǔ)運(yùn),貨架期短;硬質(zhì)型桃果實(shí)在成熟過程中生長素和乙烯釋放量都維持在較低的水平,果實(shí)成熟后無論是掛樹還是采收均不變軟。本研究為闡明生長素和乙烯協(xié)同調(diào)控桃果實(shí)成熟的分子機(jī)制,以MF和SH兩種不同肉質(zhì)類型桃為實(shí)驗(yàn)材料,篩選在兩種肉質(zhì)桃中表達(dá)差異顯著的生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵響應(yīng)因子AUX/IAA和乙烯響應(yīng)因子(Ethylene responsive factor,ERF),并通過Y1H、EMSA、DLR、桃瞬時(shí)表達(dá)、Y2H、BiFC、pull-down等實(shí)驗(yàn)研究AUX/IAA或ERFs調(diào)控桃成熟相關(guān)基因(PG、ACS、ACO、NCEDs等)表達(dá)的分子機(jī)制,以及AUX/IAA和ERFs之間的調(diào)控關(guān)系,進(jìn)一步明確生長素和乙烯在桃果實(shí)成熟過程中的作用,為培育耐儲(chǔ)運(yùn)、貨架期長的桃新品種奠定理論基礎(chǔ)。1.桃果實(shí)成熟相關(guān)ERFs篩選利用番茄的ERF蛋白在桃數(shù)據(jù)庫中Blastp ERFs轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)合‘中油桃13’(CN13)和‘中油桃16’(CN16)果實(shí)成熟不同時(shí)期(S3、S4I、S4II、S4III)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),初步篩選到15個(gè)在CN13和CN16中的表達(dá)水平存在顯著差異的ERF轉(zhuǎn)錄因子。利用qRT-PCR進(jìn)一步從15個(gè)候選ERFs轉(zhuǎn)錄因子中篩選到在MF和SH兩種果肉中表達(dá)存在顯著差異的7個(gè)ERF基因基因Prupe.1G037700(PpERF1)、Prupe.5G090800(PpERF2)、Prupe.7G194400(PpERF3)、Prupe.1G390800(PpERF4)、Prupe.5G061800(PpERF5)、Prupe.3G240000(PpERF6)、Prupe.2G289500(PpERF7)。2.PpERF2、PpERF3、PpERF4調(diào)控果實(shí)成熟相關(guān)基因表達(dá)通過轉(zhuǎn)錄組分析和qPCR驗(yàn)證篩選到與候選ERFs基因和乙烯合成基因表達(dá)趨勢相似的ABA合成基因PpNCED2、PpNCED3和細(xì)胞壁降解相關(guān)基因PpPG1。在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)在PpNCED2、PpNCED3、PpPG1啟動(dòng)子上含有ERFs(CCGAC、A/GCCGAC、AA/TTTCAAA)結(jié)合元件和生長素響應(yīng)元件(CCGACA、TGTCTC)。酵母單雜交和EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PpERF2通過CCGAC元件直接結(jié)合PpNCED2、PpNCED3、PpPG1啟動(dòng)子;PpERF3結(jié)合PpNCED2和PpNCED3啟動(dòng)子;PpERF4通過CCGAC、AGCCGCC元件直接結(jié)合在PpNCED2、PpNCED3、PpPG1和PpACO1啟動(dòng)子。煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PpERF2為轉(zhuǎn)錄抑制子;PpERF3和PpERF4為轉(zhuǎn)錄激活子。3.PpIAA1調(diào)控桃果實(shí)成熟軟化機(jī)理研究在桃基因組中鑒定到22個(gè)AUX/IAA,22個(gè)AUX/IAA基因中的一些基因在?CN13?中的表達(dá)水平明顯的高于在?CN16?中的表達(dá),其中包括ppa010303(PpIAA1)基因。酵母單雜交和凝膠滯留(EMSA)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PpIAA1能通過CCGACA、TGTCTC、TGTG?TGTG元件分別結(jié)合在PpNCED2、PpPG1、PpNCED3、PpACS1啟動(dòng)子上。瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PpIAA1為轉(zhuǎn)錄激活子。酵母雙雜交、BiFC和pull-down結(jié)果表明PpERF4與PpIAA1互作。與野生型番茄相比,轉(zhuǎn)基因株系植株呈現(xiàn)出沒有分支、根系數(shù)目減少等性狀。轉(zhuǎn)基因株系番茄果實(shí)成熟早,且采后儲(chǔ)藏性降低。以上結(jié)果表明1)PpIAA1可直接結(jié)合PpACS1、PpNCED2、PpNCED3、PpPG1啟動(dòng)子,并激活基因的表達(dá)。2)PpIAA1與PpERF4互作,并能進(jìn)一步激活PpNCED2、PpNCED3、PpPG1基因的轉(zhuǎn)錄活性。3)PpERF4結(jié)合并促進(jìn)PpIAA1的表達(dá)。通過PpIAA1和PpERF4之間合作的這3種機(jī)制,生長素和乙烯共同調(diào)控桃果實(shí)成熟和軟化。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S662.1
【圖文】：

圖 1-1 乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Liu et al 2015)。Fig. 1-1 ethylene signal transduction pathway (Liu et al 2015).1.2.2 生長素與果實(shí)成熟研究表明硬質(zhì)型桃中乙烯合成基因 PpACS1 的表達(dá)受到抑制是乙烯合成量低的原因（Tatsuki et al 2006）。最近的研究表明硬質(zhì)型桃中低濃度的生長素是抑制基因 PpACS1 表達(dá)的原因，因噴施外源萘乙酸（NAA），可以顯著的提高乙烯合成基因 PpACS1 的表達(dá)水平，乙烯產(chǎn)量明顯增加，果實(shí)變軟（Tatsuki et al 2013在植物器官中已經(jīng)研究了調(diào)節(jié)生長素動(dòng)態(tài)平衡的多種機(jī)制，如生長素代謝載體依賴的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間生長素運(yùn)輸（Rosquete et al 2012）。長時(shí)間以來，生長素被認(rèn)為是果實(shí)成熟的負(fù)調(diào)控因子，因?yàn)樵诠麑?shí)成熟期生長素的濃度很低（Nitsch 1952）。果實(shí)成熟初期生長素濃度的下降被認(rèn)為是果實(shí)成熟期的必備條件（Given et al 1988，Chen et al 1999，Purgatto et al 2002，B ttcher et al 2010）噴施外源生長素使果實(shí)成熟延遲（Cohen 1996，Purgatto et al 2002，F(xiàn)abbroni et

Oetiker et al 1997，Nakatsuka et al 1998， Shiu et al 1998）。其中個(gè)基因在果實(shí)成熟過程中的表達(dá)模式不同：LeACS1A、LeACS2、LeACS4LeACS6（Barry et al 2000）。Barry 等（2000）提出了一個(gè)模型來解釋在番茄成過程中這些基因的不同調(diào)控模式（圖 1-2）（Serreze et al 2000）。簡而言之，在統(tǒng) 1 中，基因 LeACS6 起主要的作用，盡管基因 LeACS1A 在這些組織中也有達(dá)。在果實(shí)成熟轉(zhuǎn)化期，基因 LeACS1A 和 LeACS4 開始表達(dá)并且依賴于轉(zhuǎn)錄子 RIN MADS-box 的調(diào)控。隨著乙烯合成量的增多，基因 LeACS2 隨之也開始達(dá)，這就形成了系統(tǒng) 2 乙烯合成的自體調(diào)控模式。番茄中的 5 個(gè) ACO（LeACO1-5），其中有 3 種酶在果實(shí)中的表達(dá)模式不同（LeACO1、LeACOLeACO4）（Blume et al 1997，Van-der-Hoeven et al 2002）�；� LeACO1 和 LeA在系統(tǒng) 1 中持續(xù)表達(dá)，但是在進(jìn)入系統(tǒng) 2 時(shí)，其表達(dá)水平會(huì)顯著的增加。然而果實(shí)成熟過程中基因 LeACO1 和 LeACO4 的表達(dá)水平一直很穩(wěn)定。

EIN3 二聚體可以特異的結(jié)合于轉(zhuǎn)錄因子 ERF1 啟動(dòng)子的上游的特定序列。EIN3 的兩個(gè)同源二聚體 EIL1 和 EIL2 同樣具有結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 ERF1 啟動(dòng)子特定序列的能力；在沒有乙烯存在的情況下，EIN3/EIL1 二聚體就會(huì)被兩個(gè) F-box蛋白 EBF1/EBF2 通過泛素化而降解（Solano et al 1998，Guo et al 2003）。在乙烯存在的情況下，通過進(jìn)入細(xì)胞核中的 EIN2 C 端的作用可以降解 EBF1/EBF2 二聚體，并穩(wěn)定 EIN3/EIL1 二聚體來響應(yīng)乙烯應(yīng)答基因（Potuschak et al 2003，An et al2010）。當(dāng)用空氣處理時(shí)，CIR1 可以直接結(jié)合并磷酸化至少 EIN2-C 端的兩個(gè)位點(diǎn)Ser645（S645）和 S924（Wen et al 2012，Qiao et al 2012）。而乙烯可以使 CTR1失活，并失去使 EIN2 磷酸化的能力，這種去磷酸化的 EIN2 的 C 端就會(huì)斷裂并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，EIN2 的 C 端可以通過抑制二聚體 EBF1/EBF2 的泛素化活性來穩(wěn)定 EIN3/EIL1 二聚體并響應(yīng)乙烯應(yīng)答信號(hào)（Ju et al 2012）（圖 1-3）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號(hào)：2762048