【摘要】：獼猴桃果實維生素C含量高,具有均衡的礦物質營養(yǎng)、膳食纖維和利于人體健康的代謝物組分,被譽為“水果之王”。果皮毛是影響獼猴桃外觀品質和消費的因素之一,果實少毛或無毛是獼猴桃育種的主要目標之一。本論文以‘紅陽’獼猴桃(Actinidia chinensis cv.‘Hongyang’)、毛花獼猴桃(Actinidia eriantha)、和山梨獼猴桃(Actinidia rufa)為材料,基于獼猴桃二代和三代轉錄組數(shù)據(jù),篩選出2個調(diào)控獼猴桃表皮毛發(fā)育的候選基因并在六倍體美味獼猴桃‘海沃德’(Actinidia deliciosa‘Hayward’)中進行基因編輯研究,以篩選出調(diào)控獼猴桃表皮毛發(fā)育的基因,為基因編輯育種奠定基礎。本試驗主要結果如下:1.以AtGL1、AtGL2、AtGL3、AtTTG1和AtSAD2等5個調(diào)控擬南芥表皮毛起始和發(fā)育的基因為模板,基于獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫,通過比對獲得了相應的同源基因,通過蛋白質序列比對和進化樹的構建和分析,分別獲得了AtGL1的候選基因Achn116791,AtGL2的候選基因Achn198951,AtGL3的候選基因Achn244201、Achn302211和Achn071731,AtTTG1的候選基因Achn045741,AtSAD2的候選基因Achn379131和Achn379141。分析了上述候選基因在紅陽獼猴桃、毛花獼猴桃和山梨獼猴桃的幼果、成熟葉和莖尖的表達水平以及在紅陽獼猴桃果實不同發(fā)育階段的表達水平。最后篩選出了2個調(diào)控獼猴桃表皮毛發(fā)育的候選基因:AtGL1的候選基因Achn116791和AtGL3的候選基因Achn302211,而基因AtSAD2的候選基因Achn379131可能不是調(diào)控獼猴桃表皮毛發(fā)育的關鍵基因。2.選取候選基因Achn116791,Achn302211和Achn379131為目標基因,利用軟件CRISPRdirect,根據(jù)sgRNA設計的原則,對目標基因進行sgRNA設計,成功構建了目標基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體,利用農(nóng)桿菌介導法轉化海沃德獼猴桃葉盤。經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定,我們獲得了16個獼猴桃Achn116791轉基因株系,經(jīng)測序分析有9個株系發(fā)生了堿基的插入、缺失或替換。通過葉片表皮毛的觀察,4號、5號和6號株系的葉片表皮毛密度降低、長度變短;我們獲得了4個獼猴桃Achn302211轉基因株系,其中1個株系發(fā)生了堿基的插入,引起了葉片表皮毛密度降低、長度變短;我們獲得了4個獼猴桃Achn379131轉基因株系,但均未檢測到靶位點被編輯。這些結果不僅說明Achn116791基因和Achn302211基因調(diào)控著獼猴桃葉片表皮毛的發(fā)育,也證實了在六倍體海沃德獼猴桃中可以利用CRISPR/Cas9技術進行基因編輯,且在本試驗轉基因株系中基因編輯效率為41.7%。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S663.4

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