【摘要】：梨(Pyrus spp.)是一種重要的溫帶水果,因其肉質(zhì)甜美多汁及其優(yōu)良的食用、營養(yǎng)、藥用和經(jīng)濟(jì)價值而聞名于世。近年來,隨著人民生活水平和果樹產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新水平的提高,梨品質(zhì)育種日益重要。但梨許多重要的品質(zhì)性狀受到多基因和環(huán)境的共同作用影響,對其進(jìn)行遺傳改良很困難,并且梨世代周期較長,遺傳背景復(fù)雜,使用傳統(tǒng)方法育種的效率較低。本研究以‘蘋果梨’ב八月紅’的150株F1雜交后代為試材,采用重測序技術(shù)開發(fā)SNP標(biāo)記,結(jié)合SSR標(biāo)記,構(gòu)建梨高密度遺傳連鎖圖譜。同時,根據(jù)調(diào)查的群體后代單株的果實(shí)性狀數(shù)據(jù),結(jié)合已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜,利用復(fù)合區(qū)間作圖法對相關(guān)性狀進(jìn)行定位分析。主要結(jié)果如下:1.利用‘蘋果梨’和‘八月紅’2個親本及150個F1群體單株為試材,對來源的不同的220對SSR引物進(jìn)行篩選,得到在親本間有效擴(kuò)增的引物比例在56.4%,多態(tài)性比例為42.3%,其中符合作圖要求的SSR引物占22.3%,共49對。2.利用重測序的方法,在親本間共檢測到3304623個且深度不低于4×的SNP標(biāo)記,以Bin為作圖標(biāo)記,構(gòu)建了一張包含17個連鎖群,共3116個Bin位點(diǎn)的梨高密度遺傳連鎖圖譜。17個連鎖群的總圖距為1727.98 cM,平均圖距0.55 cM。3.將符合作圖要求的49對SSR引物,成功的把其中42對整合到上述Bin圖譜中,分別定位到15個連鎖群上,使得上述遺傳連鎖圖譜的長度增加了175.65 cM,總圖距達(dá)到1903.63 cM,連鎖群長度范圍為64.19 cM(LG15)-187.68 cM(LG3),相鄰標(biāo)記間平均距離0.47 cM-0.83 cM,其中LG13連鎖群標(biāo)記間平均距離最小,包含標(biāo)記數(shù)161個,LG17連鎖群標(biāo)記間平均距離最大,標(biāo)記數(shù)149個。除LG5和LG15連鎖群外,每條連鎖群上有1-6個SSR標(biāo)記。4.利用IBM SPSS Statistics 20和Excel 2016對親本及F1群體的14個果實(shí)品質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析,其中9個性狀(單果重、縱徑、橫徑、果形指數(shù)、果心大小、果肉硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、果梗長度)在F1群體中呈連續(xù)變異,正態(tài)或偏正態(tài)分布,為數(shù)量性狀;另5個性狀(澀味程度、紅色程度、果實(shí)形狀、萼片狀態(tài)、耐貯性)沒有明顯的連續(xù)變異,表現(xiàn)為質(zhì)量性狀特點(diǎn)。多個性狀間存在顯著相關(guān)性:果實(shí)縱徑和橫徑與單果重、果肉硬度、果梗長度、果實(shí)形狀等,性狀間相互為極顯著正相關(guān);果形指數(shù)與可溶性固形物含量、果實(shí)形狀、澀味程度和可滴定酸含量等,性狀間相互為極顯著正相關(guān);單果重與果心大小、果肉硬度呈極顯著負(fù)相關(guān);果梗長度與果肉硬度呈極顯著負(fù)相關(guān)。5.利用構(gòu)建的圖譜和性狀表型值,對14個果實(shí)品質(zhì)性狀進(jìn)行基因定位分析,并對區(qū)域內(nèi)基因進(jìn)行功能注釋。采用復(fù)合區(qū)間作圖法,共獲區(qū)間位點(diǎn)28個:5個單果重QTL位點(diǎn)、2個果心大小QTL位點(diǎn)、3個果肉硬度QTL位點(diǎn)、6個果實(shí)橫徑QTL位點(diǎn)、1個果梗長度QTL位點(diǎn)、6個可溶性固形物含量QTL位點(diǎn)、2個可滴定酸含量QTL位點(diǎn)、萼片狀態(tài)、紅色程度和果實(shí)形狀各1個區(qū)間位點(diǎn),區(qū)間內(nèi)標(biāo)簽276個,共掃描到2266個基因。其中,果實(shí)縱徑、果形指數(shù)、澀味程度和耐貯性未檢測到相關(guān)區(qū)間。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S661.2
【圖文】：

和培育后代的成本。 2001 年至 2013 年，利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（RAPD）、限制性片段長度多態(tài)性（R段長度多態(tài)性（AFLP）、簡單重復(fù)序列（SSR）等構(gòu)建的一些梨遺傳連鎖圖譜，僅記位點(diǎn)，數(shù)量有限且不利于進(jìn)行自動檢測。隨著全基因組測序的發(fā)展，SNP 成為遺建和標(biāo)記輔助育種的首選標(biāo)記，與 SSR 標(biāo)記相比，SNP 標(biāo)記更豐富且可以很容易件檢測到。本研究主要以 SNP 標(biāo)記為主，再輔以部分 SSR 標(biāo)記，結(jié)合二者優(yōu)勢構(gòu)連鎖圖譜，作為未來鑒定和解析許多梨重要和復(fù)雜遺傳性狀的基礎(chǔ)。 材料與方法1 試驗(yàn)材料研究試驗(yàn)材料為 2005 年春播種的，以蘋果梨為母本，八月紅為父本的雜交后代 21苗。母本‘蘋果梨’屬于白梨，果肉細(xì)脆多汁、清香爽口，果實(shí)扁圓形，果皮綠黃點(diǎn)狀紅暈，晚熟（9 月下旬至 10 月上旬）耐貯品種（可貯至翌年 5 月份）；父本‘八為‘早巴梨’ב早酥’，果肉酥脆多汁、風(fēng)味甜、香氣濃，果實(shí)卵圓形，果皮黃色色，中早熟（8 月中旬）不耐貯紅色新品種（常溫下貯放 7～10 天）。二者有較大遺傳植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹所試驗(yàn)基地，行株距為 3.0m×1.0m，常規(guī)管理。2010 年部果，2017 年開始調(diào)查，最終隨機(jī)選擇 150 個單株為作圖群體。

時間約 40 min。（4）上樣電泳輕輕拔掉梳子，將玻璃板安裝在電泳槽上固定，將 0.5×TBE 溶液（1.5L 左右）加入到泳槽中，用移液器將點(diǎn)樣孔中的氣泡吹跑，然后接通電源電壓調(diào)至 180 V，預(yù)電泳 30 min（去氣泡和散碎凝膠）后，，上樣量 1-2μL，Marker 為 PBR322，電泳時間約為 2h 即可停止。取玻板，取凝膠。（5）銀染用蒸餾水洗滌凝膠兩次（20s 左右），加染色液，搖床輕搖 3-5min，回收染液，蒸餾水沖洗 2 次，然后加顯色液，搖床輕搖 2-3min，條帶出現(xiàn)即終止顯影，回收顯色液，蒸餾水快速洗 2 次，拍照保存。2.1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析將初步篩選到的符合‘?dāng)M測交’五種等位基因分離類型（np×nn、hk×hk、Im×II、ef×eg、ab×cd的 SSR 引物，在雙親和 150 份雜交單株中進(jìn)行再次篩選驗(yàn)證。根據(jù) 8%非變性聚丙烯酰氨凝膠泳結(jié)果，分別觀察每對引物在每份材料中的基因分離類型，按照 CP 模型數(shù)據(jù)記錄標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行整和分析，標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)格式如下（無擴(kuò)增條帶或條帶模糊的記為“-”）：

傳標(biāo)記分為 17 個連鎖群，以連鎖群為單位，采用 HighMap（Fujisawa et al, 2011）軟件分析獲得連鎖群內(nèi) Marker 的線性排列，估算相鄰 Marker 間的遺傳距離得到高密度 Bin 遺傳連鎖圖譜。2.1.6.2 遺傳連鎖圖譜整合先將非染色體上的 Bin 標(biāo)簽對圖譜進(jìn)行加密，其中非染色體上的標(biāo)簽按照親本 10x，完整度70%，偏分離 0.01 進(jìn)行過濾，Bin 標(biāo)簽分為兩種類型，一種是已知位于哪條染色體的，不確定方向和位置的，另一種是不知道染色體等信息的，所以先將已知的標(biāo)簽按照染色體進(jìn)行加密，然后再將未知的標(biāo)簽按照連鎖關(guān)系進(jìn)行加密，構(gòu)建連鎖圖譜，構(gòu)建完成后，利用最終的圖譜使用ALLMAPS 軟件進(jìn)行掛載。然后利用 joinmap 軟件中的 modified LOD 方法計算 SSR 標(biāo)記和上圖Bin 間的 mlod 值，利用兩兩標(biāo)記間的 mlod 值將 SSR 標(biāo)記整合到不同的連鎖群上。最后將分群后的結(jié)果進(jìn)行重新排列構(gòu)圖，整合圖譜結(jié)果，最終得到 SSR+SNP 整合的高密度遺傳連鎖圖譜。2.2 結(jié)果與分析2.2.1 梨基因組 DNA 提取結(jié)果

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