【摘要】：枇杷屬薔薇科(Rosaceae)枇杷屬(Eriobotrya Lindley),是起源于我國的特色水果,具有極高的醫(yī)療保健價值。根據(jù)果肉顏色不同分為紅肉枇杷和白肉枇杷,紅肉枇杷果實帶有橙色,果肉較緊密,果皮較厚,較耐貯運,抗逆性強;白肉枇杷果肉乳白色或淡黃色,肉質(zhì)細(xì)嫩、汁多味甜,因其風(fēng)味好、口感佳而更受消費者青睞。除果肉顏色外,兩類枇杷果實在糖分積累,纖維素含量,口感風(fēng)味也存在顯著差異。迄今,枇杷基因組背景尚不清楚,與枇杷果實品質(zhì)性狀相關(guān)的基因鑒定鮮有研究報道。本研究以紅肉枇杷及其白肉突變體枇杷為材料,通過RNA-Seq技術(shù)全面分析了兩種果實間的轉(zhuǎn)錄水平上的差異,在此基礎(chǔ)上開發(fā)了差異基因的EST-SSR標(biāo)記和SNP位點,并利用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆了兩個與枇杷果肉品質(zhì)相關(guān)基因EjSWEET15和EjAO基因,并對這兩個基因進行了生物信息學(xué)分析,為枇杷果實品質(zhì)形成、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及克隆和分子標(biāo)記輔助選擇育種等研究奠定了理論基礎(chǔ)。具體研究成果如下:1、本研究對野生型紅肉枇杷和突變型白肉枇杷在果實轉(zhuǎn)色至成熟間的4個時期(盛花期后171d、175d、180d、185d)樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序。除去低質(zhì)量數(shù)據(jù)后共得到約9.5Gb的Clean reads,組裝出61 587條Unigenes(已被上傳到NCBI的Sequence Read Archive 數(shù)據(jù)庫中,登陸號為:SUB919374)。在閾值為|log2Ratio|≥1和probability0.8時,共檢測到28 216個Unigenes(13 676個上調(diào)和14 540個下調(diào))差異表達。Gene Ontology(GO)和KEGG分析表明有40個GO類別和121代謝通路顯著富集,涉及次級代謝物合成、植物激素信號傳導(dǎo)、氧化磷酸化、糖酵解、淀粉與蔗糖代謝、氨基糖與核糖代謝等。此外還從中鑒定出21個與類胡蘿卜素代謝相關(guān)的基因,大部分基因在盛花期后171d時在紅肉枇杷果肉中的表達量要顯著高于白肉枇杷。2、利用MISA軟件從野生型紅肉枇杷和突變型白肉枇杷在果實轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)篩選的6608個Unigenes中共分析得到7606個EST-SSR序列。根據(jù)退火溫度,擴增產(chǎn)物大小等指標(biāo),隨機選擇250對合成引物對野生型紅肉枇杷、突變型白肉枇杷基因組進行擴增,結(jié)果有226對擴增出清晰條帶,擴增效率為90.4%�？梢�,通過枇杷果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)平臺,發(fā)掘到可用的EST-SSR標(biāo)記的效率很高。3、通過GATK軟件對枇杷果實轉(zhuǎn)錄組全長組裝序列分析,在1361個Unigenes中發(fā)現(xiàn)2396個SNPs位點,主要突變類型是AT突變成GC(768個),其次是GC突變成AT(726個)的堿基轉(zhuǎn)換,堿基轉(zhuǎn)換突變頻率是堿基顛換的1.65倍。SNP在Unigenes中出現(xiàn)頻率為2.2%,且大部分(約87%)SNPs是無義突變,有311個SNPs是錯義突變。并從3個候選基因中發(fā)現(xiàn)了 11個SNPs與枇杷類胡蘿卜素合成有關(guān),其中至少有一個SNPs是錯義突變造成編碼的氨基酸發(fā)生改變。4、SWEET蛋白是近年來在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類糖轉(zhuǎn)運蛋白,具有2個典型的MtN3/saliva結(jié)構(gòu)域。本研究采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)和RT-PCR相結(jié)合的方法,從白肉枇杷成熟期果實中成功克隆到一個編碼SWEET蛋白的基因,命名為EjSWEET15。該基因全長1 271 bp,包含了長度為918 bp的開放閱讀框。該閱讀框編碼的氨基酸數(shù)目為305個,所形成的蛋白質(zhì)預(yù)測分子量為34.13 kDa。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示EjSWEET15在葉片和果實中高豐度表達,并且在白肉枇杷成熟期果實中的表達量遠遠高于紅肉枇杷。核苷酸多態(tài)性分析顯示EjSWEET15基因在紅肉枇杷和白肉枇杷共有4處多態(tài)性位點,其中1處位于啟動子區(qū)域,其余3處均位于開放閱讀框內(nèi),且均造成氨基酸發(fā)生改變,推測可能對EjSWEET15的酶學(xué)活性產(chǎn)生影響。EjSWEET15的克隆和多態(tài)性位點的鑒定為闡明枇杷果實品質(zhì)形成機制及枇杷遺傳改良育種提供一定的理論依據(jù)。5、果實的成熟和衰老是個復(fù)雜的生物學(xué)過程,一般認(rèn)為活性氧(ROS)在其中起著重要作用。本研究采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)和RT-PCR相結(jié)合的方法,從白肉枇杷成熟期果實中成功克隆到一個編碼抗壞血酸氧化酶(AO)的基因,命名為EjAO。該基因全長2 174 bp,包含了長度為1 605 bp的開放閱讀框。該閱讀框編碼的氨基酸數(shù)目為534個,所形成的蛋白質(zhì)預(yù)測分子量為59.39 kDa。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示EjAO在根和果實中高豐度表達,并且在白肉枇杷成熟期果實中的表達量遠遠高于紅肉枇杷。核苷酸多態(tài)性分析顯示EjAO基因在紅肉枇杷和白肉枇杷共有五處多態(tài)性位點,其中T719C和A730C均導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變,推測可能對EjAO的酶學(xué)活性產(chǎn)生影響。EjAO的克隆和多態(tài)性位點的鑒定為闡明枇杷果實成熟與衰老機制及枇杷遺傳改良育種提供了一定理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S667.3
【圖文】：

是制約枇杷種類和果實品質(zhì)口感的限制因素，紅白兩類枇杷除果肉顏色差異外，含逡逑糖量、維生素Ｃ含量、耐貯性等也是果實品質(zhì)的重要指標(biāo)。本項目組在前期研究中逡逑發(fā)現(xiàn)了一株洞庭枇杷突變體材料（見圖１－１和圖１－２），該植株野生型果實是紅肉枇逡逑杷，僅在樹千中間部位出現(xiàn)一枝芽變，芽變枝結(jié)出白肉枇杷果實，這為枇杷果實品逡逑質(zhì)生物學(xué)研宄提供了寶貴素材。通過前期的研宄發(fā)現(xiàn)，相對于野生型紅肉枇杷，突逡逑變型白肉枇杷果實成熟期稍晚５？７天，果型外觀較圓，纖維素和類胡蘿卜素含量極逡逑低，果糖和蔗糖含量分別高出野生型１４．９％和９０．９％，相對甜度高出躚生型２４．５％；逡逑維生素Ｃ含量基本一致。為全面發(fā)掘與枇杷果實品質(zhì)相關(guān)的基因差異，本研宄擬利逡逑用ＲＮＡ－ｓｅｑ對該野生型和突變型果實于盛花期后第１７１ｄ、１７５ｄ、１８０ｄ、１８５ｄ進行逡逑轉(zhuǎn)錄組測序分析，系統(tǒng)挖掘與兩類枇杷果實品質(zhì)相關(guān)的表達差異基因，開發(fā)枇杷果逡逑實品質(zhì)性狀相關(guān)的ＥＳＴ－ＳＳＲ和ＳＮＰ標(biāo)記，為枇杷果實品質(zhì)性狀基因的發(fā)掘及其分逡逑１２逡逑

據(jù)此作為取樣時間點計算依據(jù)；當(dāng)年從果實轉(zhuǎn)色到成熟分４個時期（盛花后Ｉ７１ｄ、逡逑１７５ｄ、１８０ｄ、１８５ｄ）分別取樣。每次取樣選擇外觀色澤、大小及成熟度均一的果實逡逑（見圖２－１），立即去皮和核，果肉削塊液氮冷凍處理后裝入冷凍管－８０°Ｃ冰箱保存逡逑備用。逡逑每種實驗選用混合果肉樣品，ＲＮＡ－ｓｅｑ各選取三管進行上機實驗；實時熒光定逡逑量ＰＣＲ檢測及母Ｓ灰￡￡７７５和石基因克隆及表達分析均懫用成熟期１８５ｄ果肉混逡逑合樣品開展。耳／５Ｗ￡￡７７５和／＾（０基因組織特異性表達分析選用長勢一致的白肉突逡逑變枇杷一年生實生幼苗各二株，分別S胃⑹髕�、叶，訅艮遄水冲洗夯e糜諞旱義媳４姹贛謾ｅ義希保跺義

本文編號：2755731