【摘要】：柑橘是我國(guó)重要的日常水果,市場(chǎng)上常采用貯藏的方式來(lái)延長(zhǎng)柑橘供應(yīng)期。然而在貯藏期間,柑橘果實(shí)不僅風(fēng)味變淡,還積累異味物質(zhì)乙醛和乙醇,食用價(jià)值大大降低,嚴(yán)重影響消費(fèi)者體驗(yàn)。為此,就不同柑橘品種果實(shí)乙醛、乙醇積累差異以及溫度和涂蠟對(duì)普通i*柑果實(shí)乙醛、乙醇積累的影響開(kāi)展了研究,主要結(jié)果如下:1.為解決紫外法和氮藍(lán)四唑法無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定部分樣品乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)活性的問(wèn)題,建立了一種基于3-甲基-2-苯并噻唑腙(3-methyl-2-benzothiazole hydrazine,MBTH)的ADH酶活性測(cè)定方法。該法采用HC1終止酶反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間可控,配合酶標(biāo)板可實(shí)現(xiàn)樣品批量測(cè)定,且在靈敏度和準(zhǔn)確度方面均優(yōu)于紫外法和氮藍(lán)四唑法。2.從公開(kāi)的柑橘基因組數(shù)據(jù)中鑒別出14個(gè)ADH和2個(gè)PDC(pyruvate decarboxylase,丙酮酸脫羧酶)家族成員,并基于2個(gè)甜橙果肉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確定了在果肉中表達(dá)較強(qiáng)的6個(gè)AADH成員和2個(gè)PDC成員。3.以7種寬皮柑橘、5種甜橙、1種雜柑和3種柚共4個(gè)大類16個(gè)柑橘品種為實(shí)驗(yàn)材料開(kāi)展了貯藏試驗(yàn),對(duì)果實(shí)中乙醛和乙醇積累的品種間差異進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)不同種類柑橘在乙醛、乙醇含量上有所差異,采收期果實(shí)相差幅度達(dá)20.8倍和61.1倍。大多數(shù)柑橘貯藏期間乙醛、乙醇含量升高,如普通i*柑貯藏60 d時(shí)乙醛和乙醇含量分別是0 d時(shí)的8.8倍和48.7倍,但冰糖橙和玉環(huán)柚在貯藏期間乙醛和乙醇含量變化不大(增加幅度不超過(guò)1倍甚至降低)。ADH酶活性在品種間差異高達(dá)201.5倍左右(采收期果實(shí)),大多在貯藏期間趨于上升(廣橙除外)。ADH1表達(dá)在多數(shù)柑橘中隨貯藏增強(qiáng),而AADH2和ADH3僅在個(gè)別柑橘貯藏60 d時(shí)表達(dá)增強(qiáng)。PDC活性在品種間也存在差異,采收期果實(shí)相差幅度高達(dá)6.7倍,但酶活性在貯藏期間變化不大。PDC1和PDC2表達(dá)在不同柑橘品種間以及貯藏期間的變化幅度也較小,大多不超過(guò)1倍。乙醛和乙醇含量、ADH和PDC酶活性、ADH和PDC各成員表達(dá)之間的相關(guān)性分析表明PDC酶活性和基因表達(dá)與乙醛、乙醇積累密切相關(guān),而ADH酶活性與乙醛和乙醇積累相關(guān)性較弱,表明PDC可能是調(diào)控柑橘采后果實(shí)乙醛和乙醇積累的限制因子。4.為進(jìn)一步探討ADH和PDC在乙醛、乙醇積累中的作用,比較了不同溫度貯藏和涂蠟處理的效應(yīng)。研究表明,低溫下(5℃)普通碰柑在貯藏初期乙醛、乙醇含量雖呈上升趨勢(shì),但增勢(shì)較緩,且含量始終低于15℃下貯藏的i*柑,然而在90 d時(shí)乙醇含量增至與15℃下接近而乙醛含量則高于15℃下,伴有ADH和PDC表達(dá)高于15℃果實(shí),但ADH酶和PDC酶活性略低于15℃。就i*柑而言,ADH酶活性與乙醛含量相關(guān)性可達(dá)0.9以上。涂蠟處理后普通碰柑果實(shí)中乙醛和乙醇隨貯藏不斷積累,后期一直高于對(duì)照,伴有高于對(duì)照的ADH和PDC酶活性以及基因表達(dá)。ADH酶和PDC酶活性分別與乙醛和乙醇含量高度相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S666
【圖文】：

２．２．２顯色反應(yīng)的穩(wěn)定時(shí)間逡逑選取了乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液中的任意三個(gè)濃度（濃度高低依次為Ａ＜Ｂ＜Ｃ）對(duì)顯逡逑色反應(yīng)的穩(wěn)定時(shí)間進(jìn)行了分析。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖２．１我們可以看出，不同濃度的乙逡逑醛溶液在顯色反應(yīng)后的１２邋ｈ內(nèi)均能夠保持較高的穩(wěn)定性（Ａ／Ａ0＞邋８５％），但濃度逡逑越高，顯色穩(wěn)定性下降。而在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，也沒(méi)有過(guò)夜放置的需求和必要，因而逡逑在顯色反應(yīng)后１邋ｈ內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)是一個(gè)比較寬裕且合適的選擇（Ａ／Ａ0＞邋９９％）。逡逑；Ｍａ￣逡逑０邐０．５邐１邐２邐４邐６邐８邐１０邐１２逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｈ）逡逑圖２．１顯色反應(yīng)穩(wěn)定時(shí)間分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｃｏｌｏｒ－ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｓｔａｂｉｌｉｔｙ邋ｔｉｍｅ邋ａｎａｌｙｓｉｓ逡逑２．２．３反應(yīng)時(shí)間確定逡逑為確定不同方法的最佳反應(yīng)時(shí)間，我們?nèi)⊥粯悠�，分別用三種方法分析。逡逑ＵＶ法在啟動(dòng)反應(yīng)后的第０、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０邋ｍｉｎ分別測(cè)定Ａｍｏ；逡逑ＮＢＴ邋法在開(kāi)始孵育的第邋５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０邋ｍｉｎ逡逑分別測(cè)定Ａ５９０；邋ＭＢＴＨ法則在開(kāi)始酶反應(yīng)后的０、１５、３０、６０、９０、１２０邋ｍｉｎ加逡逑入ＭＢＴＨ鹽酸溶液終止反應(yīng)，經(jīng)顯色反應(yīng)后分別測(cè)定八６１0。逡逑１２逡逑

可以看到在ＵＶ法中兩個(gè)明顯的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，分別是第５邋ｍｉｎ和第２０ｍｉｎ處（圖逡逑２．２Ａ），因而該方法最佳的測(cè)定時(shí)間應(yīng)當(dāng)設(shè)定在５邋ｍｉｎ。而ＮＢＴ法，整體呈現(xiàn)出逡逑頭重腳輕的Ｓ型曲線（圖２．２Ｂ）。在最初避光孵育時(shí)間不足時(shí)，吸光度的增長(zhǎng)稍逡逑慢，但適當(dāng)時(shí)間的孵育后，能夠呈現(xiàn)出較好的趨勢(shì)（１５－３０ｍｉｎ），而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)逡逑顯色物質(zhì)不夠穩(wěn)定而導(dǎo)致吸光度反而有所下降，故選定２０邋ｍｉｎ最為該方法的最逡逑佳測(cè)定點(diǎn)。與ＮＢＴ法的邊反應(yīng)邊測(cè)定相比，ＭＢＴＨ先反應(yīng)后測(cè)定，避免了顯色逡逑物質(zhì)不穩(wěn)定帶來(lái)的測(cè)定問(wèn)題，但也出現(xiàn)反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（超過(guò)３０邋ｍｉｎ）時(shí)產(chǎn)物并不逡逑線性增加的情況，故設(shè)定３０邋ｍｉｎ為最佳時(shí)間點(diǎn)（圖２．２邋Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ逡逑ＯＴ邐１．６邐１．Ｓ邋？逡逑Ｉ０４＇邐１0－８．邐／邐１0９－邋Ｚ逡逑７邐：：：／逡逑０邐邐．邐．邐；—邐０邐￣￣Ｉ邐邐邐邐邐邐邐．邐．—邐0邋Ｙ－邐．邐１邐１邐：邐邐邐ｒ－逡逑０邐１０邐２０邐？０邐Ｃ邋２５邐３０邐４５邐６０邐７５邐９０邐０邐２０邐４０邐６０邐８０邐１００邐１２０逡逑Ｔｉｍｅ邋Ｃｍｌｎ）邐Ｔｉｍｅ邋Ｃｗｌｎ）邐Ｔｉｍｅ邋（ｍｉｎ）逡逑圖２．２三種方法反應(yīng)時(shí)間確定逡逑Ａ：邋ＵＶ；邋Ｂ：邋ＮＢＴ；邋Ｃ：邋ＭＢＴＨ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｉｍｅ－ｃｏｕｒｓｅ逡逑Ａ：邋ＵＶ；邋Ｂ：邋ＮＢＴ；邋Ｃ：邋ＭＢＴＨ逡逑２．２．４重復(fù)性分析逡逑為比較三種方法的重復(fù)性優(yōu)良，我們?nèi)¤郑╰/溪蜜柚，記為樣品Ａ）、甜橙逡逑（紐荷爾臍橙

但高度保守，均含有中鏈脫氫酶的三種特征序列：Ｚｎｌ結(jié)合區(qū)、Ｚｎ２結(jié)逡逑合區(qū)和輔酶結(jié)合區(qū)（Ｊｉｎ等，２０１６）。甜橙ＰＤＣ基因僅有兩個(gè)，其中逡逑與ＣＷ７ＰＤＣ２親緣關(guān)系較近，而ＣｓＰＤＣ２與較同源（圖３．２邋）。兩個(gè)ＣｓＰＺ）Ｃ逡逑基因同源性可徸８２°／0，與擬南芥NBｒ／ＷＣ？、的同源性也均在８１％及以上。逡逑對(duì)ＣｓｌＤ／／和ＣｓＰＤＣ的亞細(xì)胞預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，１４個(gè)ＣＭＤ／／可能僅位于細(xì)胞質(zhì)中，逡逑而ＣｘＰＤＣ則既定位于細(xì)胞核中也定位于細(xì)胞質(zhì)中。逡逑１９逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2751209