【摘要】：由致病真菌Botryosphaeria dothidea所引起的蘋果輪紋病嚴(yán)重影響蘋果果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重制約蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前對于該病的防治尚無十分行之有效的方法。研究蘋果輪紋病的免疫信號途徑,發(fā)掘調(diào)控蘋果輪紋病抗性基因,培育蘋果抗病新品種,對于改善蘋果輪紋病造成的損失具有重要的意義。蘋果在遭受輪紋病菌侵染時,由病原菌相關(guān)分子模式(PAMPs)激發(fā)的免疫反應(yīng)途徑(PTI)隨即被激活。植物與病原菌互作過程中通常會激發(fā)激素水平的變化,研究蘋果與輪紋病菌互作的機(jī)制豐富了蘋果本身的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而目前對蘋果與輪紋病菌互作的機(jī)制研究較少。輪紋病菌在侵染蘋果果實(shí)的同時,伴隨著乙烯的大量合成。而乙烯在兩者互作過程中的作用及具體的調(diào)控機(jī)制尚未可知。本研究以'富士'未成熟果實(shí)和蘋果愈傷細(xì)胞為試材,接種輪紋病菌的同時施加外源乙烯,運(yùn)用遺傳學(xué)和生化方法研究乙烯在病菌侵染過程中所起的作用及其調(diào)控機(jī)制。首先明確了乙烯對二者互作過程的影響:乙烯作為致病因子特異性增強(qiáng)了蘋果對輪紋病菌的感病性。其次通過植物中廣泛存在的MAPK級聯(lián)途徑分析了乙烯負(fù)調(diào)控蘋果MAPK-WRKY33免疫信號途徑的分子機(jī)制。具體研究結(jié)果如下:1、乙烯負(fù)調(diào)控蘋果對于輪紋病菌的抗性,且這種調(diào)控是特異的,因病菌的差異而不同。乙烯作為蘋果的抗病因子,減弱了對灰霉病和蘋果腐爛病的病斑擴(kuò)展,而與二者相反的是,對于輪紋病菌,乙烯則加快了病菌的侵染,且在蘋果果實(shí)和愈傷中的表型相同,表明這種作用無組織差異性,因此蘋果與輪紋病菌的互作是特異的。2、目前對于蘋果輪紋病與MAPK級聯(lián)途徑的研究尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明輪紋病菌侵染過程中,乙烯特異的抑制了 MAPK活性,而對于腐爛病菌則正好相反,乙烯增強(qiáng)了其MAPK活性。3、MAPK的活性改變,其下游靶標(biāo)基因的表達(dá)水平也隨之改變。隨著乙烯處理濃度的增強(qiáng),MdWRKY33-1/2/3、MdPR4/5/8/以及MdChiB-1的表達(dá)呈梯度下降趨勢,而MdWRKY40、MdERF3/6、MdChiB-2以及MdPG1等的表達(dá)則與乙烯的劑量不成比例。說明乙烯特異性降低了MdWRKY33-1/2/3、MdPR4/5//以及MdChiB-1的轉(zhuǎn)錄水平。4、本研究中Western blot結(jié)果顯示乙烯主要影響了 MPK3/6的活性。將蘋果中MdMPK3/6構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)化蘋果愈傷后得到超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因愈傷,接種輪紋病菌后發(fā)現(xiàn),與野生型對比,超表達(dá)MdMPK3/6顯著提高了MdPR4/5/8、MdWRKY33-1的表達(dá)水平。對接菌的愈傷進(jìn)行乙烯處理,發(fā)現(xiàn)外源乙烯抑制了 MdMPK3的活性,且同時抑制了 MPK3對MdWRKY33-1的磷酸化水平,而對于MdMPK6,因其超表達(dá)后蛋白表達(dá)的本底水平過高,乙烯的作用微乎其微。雖然未能發(fā)現(xiàn)乙烯對MdMPK6活性的影響,但Pull down試驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)在輪紋病菌侵染過程中乙烯阻止了 MdMPK6與MdWRKY33-1的互作。為了驗(yàn)證乙烯對蘋果輪紋病的特異性,我們對轉(zhuǎn)基因愈傷接種了蘋果腐爛病菌,并同時施加外源乙烯后發(fā)現(xiàn),乙烯增強(qiáng)了 MdMPK3的活性及其對MdWRKY33-1的磷酸化。5、本研究中乙烯特異性抑制了蘋果輪紋病菌誘導(dǎo)的MdWRKY33-1的表達(dá),將其在蘋果愈傷細(xì)胞中超表達(dá)后發(fā)現(xiàn)MdChiB-1和MdACS5A也隨之上調(diào)表達(dá),而MdPR4/5/8則沒有明顯的變化,預(yù)示著MdWRKY33與MdChiB-1和MdACS5A之間可能存在上下調(diào)控關(guān)系。EMSA試驗(yàn)結(jié)果表明MdWRKY33-1均能與MdChiB-1和MdACS5A啟動子中的W-box特異性結(jié)合,且結(jié)合域均位于MdWRKY33-1蛋白中第一個WRKY結(jié)構(gòu)域。除W-box外,MdChiB-1啟動子的W-box附近存在一段序列:AAACT,是MdWRKY33-1與MdChiB-1啟動子的另一個結(jié)合位點(diǎn)。MdWRKY33-1與這2個位點(diǎn)形成的DNA-蛋白復(fù)合物分子量大小不同,暗示其可能通過形成同源或異源二聚體來調(diào)控MdChiB-1的表達(dá)。ChIP試驗(yàn)的結(jié)果表明乙烯抑制了 MdWRKY33-1與MdChiB-1啟動子的結(jié)合。將MdChiB-1的啟動子序列構(gòu)建到含有熒光素酶基因的瞬時表達(dá)載體中,與帶有HA標(biāo)簽的MdWRKY33-1共轉(zhuǎn)蘋果愈傷的原生質(zhì)體,檢測熒光素酶活性。結(jié)果表明MdChiB-1 pro-LUC與MdWRKY33-1-2HA共轉(zhuǎn)后熒光素酶活性有微弱提高,約為對照(MER)的2.73倍,但與AtMKK7-2HA共表達(dá)后則增強(qiáng)了熒光素酶的活性,達(dá)到對照(MER)的10.5倍,而AtMKK5則效果不明顯。Western結(jié)果顯示AtMKK7超表達(dá)后明顯激活了蘋果細(xì)胞MAPK的活性,而AtMKK5則沒有。暗示MdChiB-1的轉(zhuǎn)錄活性可能需要MAPK的激活。6、前人研究表明病菌侵染過程中乙烯的釋放是由MdACS5A、MdACS5B的誘導(dǎo)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。在蘋果愈傷中超表達(dá)MdWRKY33-1,抑制腐爛病菌的侵染,但對輪紋病的效果卻不如腐爛病顯著。MdWRKY33-1既能調(diào)控MdChiB-1,又能與MdACS5A的啟動子結(jié)合,而乙烯促進(jìn)蘋果輪紋病的侵染,因此推測MdWRKY33-1超表達(dá)對輪紋病效果不顯著的原因可能與MdACS5A有關(guān)。7、更為有趣的是,在輪紋病菌侵染過程中,MdMPK6的Western結(jié)果顯示在其目標(biāo)蛋白位置下總有一條顯著的條帶偏移,且乙烯抑制了這種偏移。MdMPK6與AtMKK7的Pull down試驗(yàn)結(jié)果表明乙烯抑制二者之間的互作。為了驗(yàn)證二者之間的互作與條帶偏移的關(guān)系,本研究對MdMPK6蛋白的修飾進(jìn)行了鑒定。分析結(jié)果表明乙烯的存在影響了該蛋白磷酸化位點(diǎn)的改變:輪紋病菌侵染使得236T位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,乙烯的介入,使得發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)從236 T變?yōu)?31 T。生化數(shù)據(jù)表明236 T位點(diǎn)的磷酸化可能參與了 MdMPK6蛋白條帶的偏移,231T位點(diǎn)的磷酸化阻止了 MdMPK6與AtMKK7的互作。具體的作用機(jī)制正在進(jìn)一步的研究中。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.611
【圖文】：

逡逑另外，ＷＲＫＹ轉(zhuǎn)錄因子除了直接與靶蛋白的啟動子結(jié)合外，還可與其他蛋白互作逡逑來調(diào)控靶蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控植物對脅迫的響應(yīng)（圖１－３）。這些互作的蛋白主要包括逡逑ＷＲＫＹ蛋白、ＶＱ蛋白、ＭＡＰＫ蛋白、染色質(zhì)重組蛋白、鈣調(diào)蛋白、１４－３－３蛋白等（Ｃｈｉ逡逑ｅｗ／．，２０１３）。擬南芥中研宄表明ＷＲＫＹ１８／４０／６０與ＡＢＩ４／５的啟動子結(jié)合，三者合作抑逡逑制其活性（Ｌｉｕｅｆａ／．，２０１２）。ＶＱ蛋白因其含有４ＶＱ’元件（ＦｘｘｘＶＱｘＬＴＧ）而得名。ＶＱ逡逑蛋白是植物中特異存在的，目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了邋３４種，而在水稻中發(fā)現(xiàn)了邋３９種。有逡逑證據(jù)表明ＷＲＫＹ轉(zhuǎn)錄因子與ＶＱ蛋白中的ＶＱ元件互作。調(diào)控種子大小途徑的關(guān)鍵因逡逑子００１１是￥（＾蛋白的一種，其與他＞１１３互作，１＾１３即為１１＾＾１０（＼＾３１＾衫0／．，２０１０）。逡逑擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)ＶＱ蛋白能夠被ＭＰＫ３／６磷酸化，又稱為ＭＶＱｓ，與ＷＲＫＹ轉(zhuǎn)錄逡逑因子互作，負(fù)調(diào)控ＷＲＫＹ轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的植物防御基因的表達(dá)（Ｐｅｃｈｅｒｅ／ａ／．，邋２０１４）。逡逑ＭＡＰＫ級聯(lián)途徑涉及到植物的防衛(wèi)反應(yīng)，是刺激信號傳遞的必經(jīng)之路。某些ＷＲＫＹ轉(zhuǎn)逡逑錄因子可做為ＭＡＰＫ的底物

（０邋ｐｐｍ、１０邋ｐｐｍ、１００邋ｐｐｍ、１０００邋ｐｐｍ、１００００邋ｐｐｍ），接種蘋果輪紋病菌邋３６邋ｈ邋后，病逡逑斑大小分別為：０．３１ｃｍ、０．８２邋ｃｍ、０．５３邋ｃｍ、０．６９邋ｃｍ、０．６０邋ｃｍ；邋Ｔ檢驗(yàn)顯示差異為極顯逡逑著（ｐ＜０．０１）（圖３－ｌａ、ｌｂ）。表明外源乙烯顯著促進(jìn)輪紋病菌在蘋果果實(shí)上造成的腐爛。逡逑為進(jìn)一步探索不同濃度乙烯對蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病的影響，在１０邋ｐｐｍ基礎(chǔ)上，將逡逑乙稀濃度進(jìn)一步降低，最低為０．０１邋ｐｐｍ，共設(shè)置０邋ｐｐｍ、０．０１邋ｐｐｍ、０．１邋ｐｐｍ、１邋ｐｐｍ、逡逑１０邋ｐｐｍ、１００邋ｐｐｍ邋６個濃度梯度。０．１邋ｐｐｍ－１００邋ｐｐｍ的乙稀都能夠在輪紋病菌接菌２天后，逡逑顯著促進(jìn)蘋果果實(shí)發(fā)病，Ｉｆ隨乙烯濃度進(jìn)一步升高，并沒有體現(xiàn)出乙烯濃度的依賴性，逡逑說明０．１－１００邋ｐｐｍ的乙烯具有飽和效應(yīng)（圖３－ｌｃ）。在接菌第４邋ｄ，低至０．０１邋ｐｐｍ的乙烯逡逑對輪紋病菌擴(kuò)展具有顯著的促進(jìn)作用，且Ｏ．Ｏｌ－ｌＯＯｐｐｍ之間并無顯著差異，接菌第６ｄ逡逑的結(jié)果同樣如此（圖３－ｌｃ）。因此，乙烯促進(jìn)蘋果輪紋病的發(fā)病，與乙烯濃度的高低無逡逑顯著相關(guān)性

的棉花球?qū)⒖字車采w，裝入２Ｌ的玻璃罐子中，同時充入不同濃度的純乙烯氣體（Ｏｐｐｍ、逡逑１００邋ｐｐｍ、１０００邋ｐｐｍ、１００００邋ｐｐｍ），接種蘋果腐爛病菌４邋ｄ后，發(fā)現(xiàn)施加１０００邋ｐｐｍ的乙逡逑q媯⒉〉牟“咧本斷災(zāi)∮詼哉眨ㄍ跡常玻�、２ｃ），１００００邋７w穡淼囊蟻�，同样架V趿似還義細(xì)貌【那秩荊保埃板澹穡穡淼囊蟻┳饔貌⒉幻饗浴０凳疽蟻┰鑾慷愿貌〉目剮砸覽靛義嫌諞蟻┑募亮�，但达到覛gǖ吶ǘ群�，呈现蚁仼饱和效应。甚r黿峁礱饕蟻┐俳似誨義瞎愿貌〉目剮�，与轮纹病蠂康A(chǔ)４硬嗝嫠得饕蟻┒雜諑治撇》⒉∮跋斕奶匾煨浴ｅ義希常保騁蟻┒雜誆煌【秩鏡鈉還說淖饔緬義弦蟻┳魑刂乒黨墑斕鬧參錛に�，栽戺控果蕶n某墑旆矯娣⒒庸丶饔謾＜諞義義舷┒云還檔奶匾煨裕敲匆蟻┒雜誆【秩鏡撓跋焓欠窠鍪視糜詮擔(dān)懇蟻┒雜諂誨義瞎治撇〉撓跋焓欠袷翹匾斕�，因此晤U且云還俗櫓牧�，牙C騁蟻┒云還治棋義喜『透貌∽饔玫淖櫓匾煨浴Ｑ∪〕な葡嗤伊己玫鈉還�，磧�(yōu)嘌矗淶模校模漣邋義仙先≈本對嘉埃擔(dān)悖淼鈉還治撇【ㄒ韻錄虺莆埃�、七�貌【ǎ疲恚┖突頤共″義暇ǎ擔(dān)悖┑木

本文編號：2747830