發(fā)布時間：2020-07-09 18:30

【摘要】：由致病真菌Botryosphaeria dothidea所引起的蘋果輪紋病嚴重影響蘋果果實的產(chǎn)量和品質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟損失,嚴重制約蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前對于該病的防治尚無十分行之有效的方法。研究蘋果輪紋病的免疫信號途徑,發(fā)掘調(diào)控蘋果輪紋病抗性基因,培育蘋果抗病新品種,對于改善蘋果輪紋病造成的損失具有重要的意義。蘋果在遭受輪紋病菌侵染時,由病原菌相關分子模式(PAMPs)激發(fā)的免疫反應途徑(PTI)隨即被激活。植物與病原菌互作過程中通常會激發(fā)激素水平的變化,研究蘋果與輪紋病菌互作的機制豐富了蘋果本身的免疫調(diào)控網(wǎng)絡。而目前對蘋果與輪紋病菌互作的機制研究較少。輪紋病菌在侵染蘋果果實的同時,伴隨著乙烯的大量合成。而乙烯在兩者互作過程中的作用及具體的調(diào)控機制尚未可知。本研究以'富士'未成熟果實和蘋果愈傷細胞為試材,接種輪紋病菌的同時施加外源乙烯,運用遺傳學和生化方法研究乙烯在病菌侵染過程中所起的作用及其調(diào)控機制。首先明確了乙烯對二者互作過程的影響:乙烯作為致病因子特異性增強了蘋果對輪紋病菌的感病性。其次通過植物中廣泛存在的MAPK級聯(lián)途徑分析了乙烯負調(diào)控蘋果MAPK-WRKY33免疫信號途徑的分子機制。具體研究結果如下:1、乙烯負調(diào)控蘋果對于輪紋病菌的抗性,且這種調(diào)控是特異的,因病菌的差異而不同。乙烯作為蘋果的抗病因子,減弱了對灰霉病和蘋果腐爛病的病斑擴展,而與二者相反的是,對于輪紋病菌,乙烯則加快了病菌的侵染,且在蘋果果實和愈傷中的表型相同,表明這種作用無組織差異性,因此蘋果與輪紋病菌的互作是特異的。2、目前對于蘋果輪紋病與MAPK級聯(lián)途徑的研究尚未見報道。本研究結果表明輪紋病菌侵染過程中,乙烯特異的抑制了 MAPK活性,而對于腐爛病菌則正好相反,乙烯增強了其MAPK活性。3、MAPK的活性改變,其下游靶標基因的表達水平也隨之改變。隨著乙烯處理濃度的增強,MdWRKY33-1/2/3、MdPR4/5/8/以及MdChiB-1的表達呈梯度下降趨勢,而MdWRKY40、MdERF3/6、MdChiB-2以及MdPG1等的表達則與乙烯的劑量不成比例。說明乙烯特異性降低了MdWRKY33-1/2/3、MdPR4/5//以及MdChiB-1的轉錄水平。4、本研究中Western blot結果顯示乙烯主要影響了 MPK3/6的活性。將蘋果中MdMPK3/6構建穩(wěn)定表達載體,分別轉化蘋果愈傷后得到超表達的轉基因愈傷,接種輪紋病菌后發(fā)現(xiàn),與野生型對比,超表達MdMPK3/6顯著提高了MdPR4/5/8、MdWRKY33-1的表達水平。對接菌的愈傷進行乙烯處理,發(fā)現(xiàn)外源乙烯抑制了 MdMPK3的活性,且同時抑制了 MPK3對MdWRKY33-1的磷酸化水平,而對于MdMPK6,因其超表達后蛋白表達的本底水平過高,乙烯的作用微乎其微。雖然未能發(fā)現(xiàn)乙烯對MdMPK6活性的影響,但Pull down試驗的結果證實在輪紋病菌侵染過程中乙烯阻止了 MdMPK6與MdWRKY33-1的互作。為了驗證乙烯對蘋果輪紋病的特異性,我們對轉基因愈傷接種了蘋果腐爛病菌,并同時施加外源乙烯后發(fā)現(xiàn),乙烯增強了 MdMPK3的活性及其對MdWRKY33-1的磷酸化。5、本研究中乙烯特異性抑制了蘋果輪紋病菌誘導的MdWRKY33-1的表達,將其在蘋果愈傷細胞中超表達后發(fā)現(xiàn)MdChiB-1和MdACS5A也隨之上調(diào)表達,而MdPR4/5/8則沒有明顯的變化,預示著MdWRKY33與MdChiB-1和MdACS5A之間可能存在上下調(diào)控關系。EMSA試驗結果表明MdWRKY33-1均能與MdChiB-1和MdACS5A啟動子中的W-box特異性結合,且結合域均位于MdWRKY33-1蛋白中第一個WRKY結構域。除W-box外,MdChiB-1啟動子的W-box附近存在一段序列:AAACT,是MdWRKY33-1與MdChiB-1啟動子的另一個結合位點。MdWRKY33-1與這2個位點形成的DNA-蛋白復合物分子量大小不同,暗示其可能通過形成同源或異源二聚體來調(diào)控MdChiB-1的表達。ChIP試驗的結果表明乙烯抑制了 MdWRKY33-1與MdChiB-1啟動子的結合。將MdChiB-1的啟動子序列構建到含有熒光素酶基因的瞬時表達載體中,與帶有HA標簽的MdWRKY33-1共轉蘋果愈傷的原生質(zhì)體,檢測熒光素酶活性。結果表明MdChiB-1 pro-LUC與MdWRKY33-1-2HA共轉后熒光素酶活性有微弱提高,約為對照(MER)的2.73倍,但與AtMKK7-2HA共表達后則增強了熒光素酶的活性,達到對照(MER)的10.5倍,而AtMKK5則效果不明顯。Western結果顯示AtMKK7超表達后明顯激活了蘋果細胞MAPK的活性,而AtMKK5則沒有。暗示MdChiB-1的轉錄活性可能需要MAPK的激活。6、前人研究表明病菌侵染過程中乙烯的釋放是由MdACS5A、MdACS5B的誘導表達來實現(xiàn)的。在蘋果愈傷中超表達MdWRKY33-1,抑制腐爛病菌的侵染,但對輪紋病的效果卻不如腐爛病顯著。MdWRKY33-1既能調(diào)控MdChiB-1,又能與MdACS5A的啟動子結合,而乙烯促進蘋果輪紋病的侵染,因此推測MdWRKY33-1超表達對輪紋病效果不顯著的原因可能與MdACS5A有關。7、更為有趣的是,在輪紋病菌侵染過程中,MdMPK6的Western結果顯示在其目標蛋白位置下總有一條顯著的條帶偏移,且乙烯抑制了這種偏移。MdMPK6與AtMKK7的Pull down試驗結果表明乙烯抑制二者之間的互作。為了驗證二者之間的互作與條帶偏移的關系,本研究對MdMPK6蛋白的修飾進行了鑒定。分析結果表明乙烯的存在影響了該蛋白磷酸化位點的改變:輪紋病菌侵染使得236T位點發(fā)生磷酸化,乙烯的介入,使得發(fā)生磷酸化的位點從236 T變?yōu)?31 T。生化數(shù)據(jù)表明236 T位點的磷酸化可能參與了 MdMPK6蛋白條帶的偏移,231T位點的磷酸化阻止了 MdMPK6與AtMKK7的互作。具體的作用機制正在進一步的研究中。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S436.611
【圖文】：

逡逑另外，ＷＲＫＹ轉錄因子除了直接與靶蛋白的啟動子結合外，還可與其他蛋白互作逡逑來調(diào)控靶蛋白的表達，從而調(diào)控植物對脅迫的響應（圖１－３）。這些互作的蛋白主要包括逡逑ＷＲＫＹ蛋白、ＶＱ蛋白、ＭＡＰＫ蛋白、染色質(zhì)重組蛋白、鈣調(diào)蛋白、１４－３－３蛋白等（Ｃｈｉ逡逑ｅｗ／．，２０１３）。擬南芥中研宄表明ＷＲＫＹ１８／４０／６０與ＡＢＩ４／５的啟動子結合，三者合作抑逡逑制其活性（Ｌｉｕｅｆａ／．，２０１２）。ＶＱ蛋白因其含有４ＶＱ’元件（ＦｘｘｘＶＱｘＬＴＧ）而得名。ＶＱ逡逑蛋白是植物中特異存在的，目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了邋３４種，而在水稻中發(fā)現(xiàn)了邋３９種。有逡逑證據(jù)表明ＷＲＫＹ轉錄因子與ＶＱ蛋白中的ＶＱ元件互作。調(diào)控種子大小途徑的關鍵因逡逑子００１１是￥（＾蛋白的一種，其與他＞１１３互作，１＾１３即為１１＾＾１０（＼＾３１＾衫0／．，２０１０）。逡逑擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)ＶＱ蛋白能夠被ＭＰＫ３／６磷酸化，又稱為ＭＶＱｓ，與ＷＲＫＹ轉錄逡逑因子互作，負調(diào)控ＷＲＫＹ轉錄因子介導的植物防御基因的表達（Ｐｅｃｈｅｒｅ／ａ／．，邋２０１４）。逡逑ＭＡＰＫ級聯(lián)途徑涉及到植物的防衛(wèi)反應，是刺激信號傳遞的必經(jīng)之路。某些ＷＲＫＹ轉逡逑錄因子可做為ＭＡＰＫ的底物

（０邋ｐｐｍ、１０邋ｐｐｍ、１００邋ｐｐｍ、１０００邋ｐｐｍ、１００００邋ｐｐｍ），接種蘋果輪紋病菌邋３６邋ｈ邋后，病逡逑斑大小分別為：０．３１ｃｍ、０．８２邋ｃｍ、０．５３邋ｃｍ、０．６９邋ｃｍ、０．６０邋ｃｍ；邋Ｔ檢驗顯示差異為極顯逡逑著（ｐ＜０．０１）（圖３－ｌａ、ｌｂ）。表明外源乙烯顯著促進輪紋病菌在蘋果果實上造成的腐爛。逡逑為進一步探索不同濃度乙烯對蘋果果實輪紋病發(fā)病的影響，在１０邋ｐｐｍ基礎上，將逡逑乙稀濃度進一步降低，最低為０．０１邋ｐｐｍ，共設置０邋ｐｐｍ、０．０１邋ｐｐｍ、０．１邋ｐｐｍ、１邋ｐｐｍ、逡逑１０邋ｐｐｍ、１００邋ｐｐｍ邋６個濃度梯度。０．１邋ｐｐｍ－１００邋ｐｐｍ的乙稀都能夠在輪紋病菌接菌２天后，逡逑顯著促進蘋果果實發(fā)病，Ｉｆ隨乙烯濃度進一步升高，并沒有體現(xiàn)出乙烯濃度的依賴性，逡逑說明０．１－１００邋ｐｐｍ的乙烯具有飽和效應（圖３－ｌｃ）。在接菌第４邋ｄ，低至０．０１邋ｐｐｍ的乙烯逡逑對輪紋病菌擴展具有顯著的促進作用，且Ｏ．Ｏｌ－ｌＯＯｐｐｍ之間并無顯著差異，接菌第６ｄ逡逑的結果同樣如此（圖３－ｌｃ）。因此，乙烯促進蘋果輪紋病的發(fā)病，與乙烯濃度的高低無逡逑顯著相關性

的棉花球?qū)⒖字車采w，裝入２Ｌ的玻璃罐子中，同時充入不同濃度的純乙烯氣體（Ｏｐｐｍ、逡逑１００邋ｐｐｍ、１０００邋ｐｐｍ、１００００邋ｐｐｍ），接種蘋果腐爛病菌４邋ｄ后，發(fā)現(xiàn)施加１０００邋ｐｐｍ的乙逡逑q媯⒉〉牟“咧本斷災∮詼哉眨ㄍ跡常玻�、２ｃ），１００００邋７w穡淼囊蟻�，同样架V趿似還義細貌【那秩荊保埃板澹穡穡淼囊蟻┳饔貌⒉幻饗�。暗示蚁仼澡幙对腐烂病的縿幵矣[靛義嫌諞蟻┑募亮�，但达到覛gǖ吶ǘ群�，呈现蚁仼饱和效应。甚r黿峁礱饕蟻┐俳似誨義瞎愿貌〉目剮�，与轮纹病蠂康A４硬嗝嫠得饕蟻┒雜諑治撇》⒉∮跋斕奶匾煨�。辶x希常保騁蟻┒雜誆煌【秩鏡鈉還說淖饔緬義弦蟻┳魑刂乒黨墑斕鬧參錛に�，栽戺控果蕶n某墑旆矯娣⒒庸丶饔謾＜諞義義舷┒云還檔奶匾煨�，那么蚁仼峨s誆【秩鏡撓跋焓欠窠鍪視糜詮擔懇蟻┒雜諂誨義瞎治撇〉撓跋焓欠袷翹匾斕�，因此晤U且云還俗櫓牧�，牙C騁蟻┒云還治棋義喜『透貌∽饔玫淖櫓匾煨�。选取长势相同且良好碘c還�，磧�(yōu)嘌矗淶模校模漣邋義仙先≈本對嘉埃擔悖淼鈉還治撇【ㄒ韻錄虺莆埃�、七�貌【ǎ疲恚┖突頤共″義暇ǎ擔悖┑木

本文編號：2747830