【摘要】：相柑橘黃龍病(CitrusHuanglongbing),屬于系統(tǒng)侵染的細菌病害,病原是韌皮部桿菌亞洲種(CandidatusLiberibacterasiaticus),屬于難培養(yǎng)細菌。該病病癥復(fù)雜,易與缺素、病毒病害等混淆。柑橘黃龍病在中國發(fā)生很嚴重,嚴重為害柑橘產(chǎn)業(yè)。目前對于黃龍病尚無有效治理手段,主要依靠嚴格的檢疫措施防止該病擴散,所以建立高效,快捷,操作簡單的檢測技術(shù),為疑似柑桔黃龍病初期的診斷提供準確、可靠的檢驗檢疫技術(shù),是防止此病原菌傳播有效手段�，F(xiàn)在檢驗柑橘黃龍病菌的主要方法是PCR,雖然簡單快捷、準確靈敏,但是由于柑橘黃龍病原是難培養(yǎng)細菌,在植株組織中分布不均且含量少,病原DNA的獲得過程繁瑣,再加上當(dāng)前的大多數(shù)黃龍病病原菌分子檢測使用的靶標均未經(jīng)過基因組比較,因而常規(guī)PCR有時會出現(xiàn)假陰性或假陽性問題。本實驗通過本地BLAST軟件,采用單序列比多序列的方法,將目的菌Ca.L.asiaticus的全基因組序列依次與同屬的每個其他種的全基因組序列進行比對。選用多序列比對的全基因組比對技術(shù),在全基因組比對的基礎(chǔ)上挑選出了合適的核心基因作為分子靶標,設(shè)計出了特異性的探針和引物,建立了 Routine PCR和TaqMan探針q-PCR的檢測方法,實驗結(jié)果表明這兩種方法均能把目標菌韌皮部桿菌亞洲種Caa.L.asi與 Cau.L.L.amenus、Caaican 及 Ca L.solanacear 3 個種區(qū)分開來,最高靈敏度達到6copies/μL,相當(dāng)于能檢測出0.01 fg/μL的DNA,具有良好的特異性和高靈敏度。對實際樣品進行檢測,能從24份湖南疑似黃龍病葉片樣品中檢測到3份帶菌,有較高的檢出率。此外,梨火疫病菌(Erwinniaamylovora)可引起梨、蘋果等薔薇科植物的火疫病。本研究從梨火疫病菌中鑒定并克隆出兩個clpV同源基因,通過同源重組的方法,構(gòu)建了梨火疫病菌的clpF基因的缺失突變體△clpV-1和△clpV-2,初步分析了△clp V-1和AclpV-2在影響病原菌致病性和梨火疫毒素產(chǎn)量的作用。結(jié)果顯示,△clpV-2與野生型相比致病性顯著降低,梨火疫毒素產(chǎn)量顯著下降,而△clpV-1與野生型相比差異不顯著。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.66
【圖文】：

在探針的３’端標記焚光淬滅基團（ｑｕｅｎｃｈｅｒ，Ｑ），如ＴＡＭＡＲ；探針設(shè)計逡逑在兩條引物之間且盡量靠近上游引物。當(dāng)探針完整時，３’端Ｑ基團吸收了儀器不能逡逑檢測到的５’端Ｒ基團發(fā)射的熒光（見圖１）。在擴增過程中，：Ｔ叫酶在延伸階段遇到逡逑同模板結(jié)合的探針時，由于具有３’邋一５’的外切酶活性，會將探針切斷，Ｒ逡逑基團分離出來，此時Ｑ基團不能吸收Ｒ基團發(fā)射的熒光，儀器就會檢測到熒光信號逡逑增強。熒光信號每經(jīng)過一個循環(huán)就有一個指數(shù)增長的過程。逡逑非探針類的ｑ－ＰＣＲ是利用只與雙鏈ＤＮＡ結(jié)合的熒光染料，在與雙鏈ＤＮＡ結(jié)合逡逑后，其熒光會大幅度增強｜５７１。常用的熒光色素有ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｎ５８］，ＰＣＲ反應(yīng)中加入逡逑熒光染料，染料特異性地結(jié)合ＤＮＡ雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而其他不是雙鏈ＤＮＡ，逡逑ＳＹＢＲ染料不與其結(jié)合就沒有熒光信號產(chǎn)生，這樣就保證了熒光信號的增強與擴增產(chǎn)逡逑物的增加同步。這種方法的優(yōu)勢在于設(shè)計的程序通用性好，方便、成本低。不足之處逡逑是由于染料對ＤＮＡ雙鏈分子沒有選擇性

Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ（ｄｄＨ２0）逡逑２．３實際樣品檢測逡逑從湖南２４份疑似黃龍病樣品中檢測出３份陽性樣品（圖２－３）。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋ＰＣ邋ＮＣ邋１邐２邐３邐４邐？邐６邐７邋Ｓ邋９逡逑－：Ｕ—％：邐＇：邋＇，：邐，｝｜ｌ：；．ｌｆ邋■邐Ｃ：＇３逡逑１；＞邋；邐』靜，邐Ａ，－邐

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本文編號：2745985