【摘要】：本研究以榨菜(Brassica juncea(L.)Czern.et Coss.var.tumitda Tsen et Lee)與紫甘藍(lán)(B.oleracea L.var.capitata L.)的莖尖嫁接嵌合體為材料,通過(guò)對(duì)組織培養(yǎng)條件下嵌合體莖段基部不定芽的誘導(dǎo)獲得嵌合體的無(wú)性繁殖后代,利用該無(wú)性后代開(kāi)展了嫁接誘導(dǎo)性狀變異及其維持機(jī)制的分子機(jī)理研究。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察以及分子標(biāo)記鑒定,明確無(wú)性后代的細(xì)胞譜系;通過(guò)全基因組甲基化圖譜分析,明確親本和后代的DNA甲基化模式差異,分析DNA甲基化變異位點(diǎn)與變異性狀的關(guān)系;通過(guò)small RNA高通量測(cè)序,解析嫁接引起的小RNA種類和表達(dá)量的變化,并通過(guò)對(duì)小干擾RNA(siRNA)和DNA甲基化的關(guān)聯(lián)分析,明確全基因組甲基化差異位點(diǎn)與siRNA的關(guān)系,闡明siRNA調(diào)控甲基化變異的機(jī)理。通過(guò)對(duì)siRNA表達(dá)模式及甲基化酶轉(zhuǎn)錄水平的分析,探究嫁接誘導(dǎo)表觀遺傳變異的維持機(jī)制。主要結(jié)果如下:(1)以榨菜和紫甘藍(lán)種間周緣嵌合體TCC[莖尖分生組織(shoot apical meristem,SAM)三個(gè)細(xì)胞層,由外而內(nèi)為L(zhǎng)Ⅰ-LⅡ-LⅢ,'T'代表LI起源于榨菜tubermustard,'C'代表LⅡ和LⅢ起源于紫甘藍(lán)red cabbage]的莖段為外植體進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo),并利用形態(tài)學(xué)特征和分子標(biāo)記鑒定不定芽的細(xì)胞譜系。在添加不同濃度6-BA的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,從莖段基部直接再生的不定芽誘導(dǎo)頻率隨6-BA濃度的升高而增大。特異引物PCR以及簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記顯示不定芽起源于紫甘藍(lán)譜系,即嵌合體SAM的LⅡ和/或LⅢ細(xì)胞層,命名為r-CCC(r=regenerated)。對(duì)r-CCC通過(guò)腋芽誘導(dǎo)進(jìn)行無(wú)性繁殖,構(gòu)建無(wú)性后代r-CCCn(n = generation)。再生的不定芽及其無(wú)性后代葉片光滑無(wú)表皮毛,葉脈處和莖為紫紅色,在形態(tài)學(xué)上與紫甘藍(lán)親本相似,然而與對(duì)照材料相比表現(xiàn)出葉片蠟質(zhì)含量明顯減少的表型變異。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析結(jié)果顯示,r-CCC中未出現(xiàn)榨菜親本的特異條帶,但與r-s-CCC(s=self-grafted)相比存在0.76%的差異條帶,且差異位點(diǎn)主要分布于非編碼的基因間區(qū)。(2)對(duì)r-CCC4和r-s-CCC4全基因組甲基化圖譜分析發(fā)現(xiàn),r-CCC4中CHH類型胞嘧啶的甲基化水平和比例均高于r-s-CCC4,并且在轉(zhuǎn)座元件等重復(fù)序列上的CHH類型甲基化水平升高最為明顯。對(duì)甲基化差異位點(diǎn)相關(guān)基因(DMG)的KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),13個(gè)DMGs參與蠟質(zhì)合成Cutin,suberine and wax biosynthesis通路。通過(guò)重亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)對(duì)基因LOC106335792,LOC106298662,LOC106311786和LOC106333935上差異位點(diǎn)的甲基化模式的驗(yàn)證結(jié)果與全基因組重亞硫酸氫鹽甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)一致。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明,差異基因在r-CCC4和r-s-CCC4中的轉(zhuǎn)錄水平不同,其中基因LOC106335792和LOC106311786在r-CCC4中的表達(dá)水平顯著降低,可能為蠟質(zhì)含量變異的候選基因。(3)對(duì)r-CCCn和r-s-CCCn中蠟質(zhì)合成相關(guān)DMGs的甲基化模式分析發(fā)現(xiàn),嫁接引起的甲基化模式變異能夠在無(wú)性繁殖過(guò)程中穩(wěn)定維持。對(duì)相關(guān)甲基化轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果表明,MET1在r-CCC2和r-CCC4的表達(dá)水平顯著升高,推測(cè)其負(fù)責(zé)維持CG類型的DNA甲基化變異;而CMT3在r-CCCn中的表達(dá)水平均低于r-s-CCCn,可能參與維持CHG類型的甲基化變異。此外,對(duì)嵌合體花粉中的甲基化模式分析發(fā)現(xiàn),DNA甲基化變異可以通過(guò)減數(shù)分裂進(jìn)行傳遞。(4)以r-s-TTT,r-s-CCC和r-CCCn為材料,通過(guò)small RNA高通量測(cè)序分析異源嫁接對(duì)小RNA種類及表達(dá)量的影響。研究結(jié)果揭示,嵌合體無(wú)性后代中絕大多數(shù)siRNA的表達(dá)水平明顯升高,并且與基因組重復(fù)序列相關(guān)小RNA的比例在無(wú)性后代中呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。在多代無(wú)性材料中鑒定到1135種嫁接誘導(dǎo)的特異siRNA,包括159種榨菜親本中的特異轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。此外,對(duì)miRNA的表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn),22種novel miRNA的表達(dá)水平在r-s-CCC和r-CCCn中表現(xiàn)出顯著差異,差異表達(dá)的novelmiRNA靶基因主要編碼功能蛋白,包括鋅指蛋白、ABC運(yùn)載體以及與抗病性有關(guān)的TAO1蛋白等。此外,一種與光周期開(kāi)花途徑相關(guān)的已知miRNAbol-miR157a在r-CCCn中被顯著抑制表達(dá)。(5)通過(guò)DNA甲基化和small RNA關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)65%的特異siRNA與重復(fù)元件相關(guān),而且重復(fù)元件相關(guān)siRNA靶定區(qū)域的CHH類型胞嘧啶在嵌合體無(wú)性后代中表現(xiàn)為高甲基化修飾。異源嫁接誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)座元件相關(guān)siRNA能夠在細(xì)胞再生和無(wú)性繁殖多代中穩(wěn)定存在,推測(cè)這些siRNA可能參與維持基因組的穩(wěn)定性,從而實(shí)現(xiàn)嫁接變異在后代的維持。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S637.3;S635
【圖文】：

博士學(xué)位論文并招募從頭甲基化酶ＤＭＨ２到靶向位點(diǎn)上建立ＤＮＡ從頭甲基化，類型甲基化（Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋｉ邋ｄａ／．，邋２００８；邋Ｌａｗ邋ａｎｄ邋Ｊａｃｏｂｓｅｎ，邋２０１０）。此外，２１－２５邋ｎｔ邋的邋ｓｉＲＮＡ邋均有可能參與邋ＲｄＤＭ邋機(jī)制（Ｍｅｉｓｔｅｒ邋ａｎｄ邋Ｔｕｓｃｈｌ，ａｔｔｕ邋ｅ／邋ａ／．，邋２０１３邋）邋０逡逑

多種植物嵌合體材料（Ｈｅｉｃｈｅｌ邋ｅ／ｆｌ／．，１９７８；邋Ｂｕｒｇｅ邋ｅ／ａ／．，邋２００２；邋Ｙｏｓｈｉｄａ邋Ｗａ／．，邋２００４），逡逑并由此推進(jìn)了對(duì)嫁接過(guò)程組織器官的發(fā)育、細(xì)胞間信息交流以及嫁接變異等問(wèn)題逡逑的研究。Ｈｉｒａｔａ和Ｎｏｇｕｃｈｉ等在Ｗｉｎｋｌｅｒ的方法上改進(jìn)的莖尖離體靠接法逡逑（ａｐｐｒｏａｃｈ－ｇｒａｆｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｖｖＹｒｏ，ＡＧＳＣ邋ｍｅｔｈｏｄ）使嫁接嵌合體的獲得更為逡逑高效，并在蕓薹屬蔬菜上獲得很大的成功（Ｈｉｒａｔａｅ／ｏ／．，邋１９９０；Ｎｏｇｕｃｈｉ邋ｅ／ａ／．，１９９２；逡逑Ｎｏｇｕｃｈｉ以ａ／．，邋１９９４；邋Ｈｉｒａｔａ邋ｅｆ邋ａ／．，２００１邋）６該方法利用試管苗嫁接法，也稱微嫁接逡逑技術(shù)，通過(guò)植物組織培養(yǎng)與離體嫁接技術(shù)的結(jié)合，將兩個(gè)嫁接材料的幼苗莖尖部逡逑位（各攜帶一片子葉）緊密靠在一起，置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待兩者之間的嫁接傷逡逑口愈合后，將嫁接體愈合的頂端、緊鄰頂端下的橫切部分以及愈合的下胚軸三個(gè)逡逑部分切離，并轉(zhuǎn)移到含有生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，嵌合體的逡逑芽便能形成，進(jìn)而由不定芽發(fā)育為完整的植株（Ｎｏｇｕｃｈｉ邋ｅ／ａ／．，１９９２）。通過(guò)該方逡逑法獲得嫁接嵌合體的效率更高，但也較易出現(xiàn)扇形嵌合體、混合型嵌合體等不穩(wěn)逡逑定類型。逡逑

濃度的提高而增加，在含有０．２邋ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ的ＭＳ培養(yǎng)基中，基部切面上產(chǎn)生少逡逑數(shù)獨(dú)立的、分散的不定芽。當(dāng)６－ＢＡ濃度升高至０．８ｍｇ／Ｌ時(shí)，基部切面上形成簇逡逑狀叢生的不定芽（圖２．１）。為便于分離和觀察，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均選用含０．２ｍｇ／Ｌ６－逡逑ＢＡ的ＭＳ培養(yǎng)基作為不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。逡逑ｒｘｘｉ逡逑圖２．１６－ＢＡ的濃度對(duì)莖段基部不定芽誘導(dǎo)頻率的影響。（ａ）和（ｄ）ＭＳ＋０．２ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ；邋（ｂ）逡逑和（ｅ）邋ＭＳ邋＋邋０．４ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ；邋（ｃ）和（ｆ）邋ＭＳ邋＋邋０．８ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｅｍ邋ｂａｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ邋ｓｈｏｏｔｓ邋ｏｎ邋ＭＳ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ逡逑ｏｆ邋６－ＢＡ．邋（ａ）邋ａｎｄ邋（ｄ）邋ＭＳ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｗｉｔｈ邋０．２邋ｍｇ／Ｌ邋６－ＢＡ．邋（ｂ）邋ａｎｄ邋（ｅ）邋ＭＳ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｗｉｔｈ邋０．４邋ｍｇ／Ｌ邋６－逡逑ＢＡ．邋（ｃ）邋ａｎｄ邋（ｆ）邋ＭＳ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｗｉｔｈ邋０．８邋ｍｇ／Ｌ邋６－ＢＡ．逡逑３０逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2745921