【摘要】：蕨類植物因其較高的觀賞及藥用價值,具有廣闊的市場應(yīng)用前景。誘導(dǎo)配子體高效形成孢子體以及探索與之相關(guān)的調(diào)控機(jī)制,是構(gòu)建蕨類植物高效繁殖體系中最重要的問題。本文以荷葉鐵線蕨(Adiantum reniforme var.sinense)作為研究材料,首先構(gòu)建了配子體分別通過有性生殖和無配子生殖方式高效產(chǎn)生孢子體的培養(yǎng)體系,并對配子體和孢子體的形態(tài)建成和微觀特征進(jìn)行觀察。在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用高通量測序以及生物信息學(xué)手段對不同生殖方式不同發(fā)育時期的配子體進(jìn)行研究,揭示與性器官分化以及無配子生殖高效產(chǎn)生孢子體過程有關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制,為蕨類植物的高效繁殖以及大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)打下理論基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:1.成功構(gòu)建配子體通過有性生殖和無配子生殖高效產(chǎn)生孢子體的培養(yǎng)體系。將配子體置于含3.0mg/L赤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng),能刺激雌性生殖器官即頸卵器的分化,產(chǎn)生密布頸卵器的配子體。對這種配子體進(jìn)行水培培養(yǎng),可以促進(jìn)受精現(xiàn)象的發(fā)生,通過有性生殖的方式高效產(chǎn)生孢子體。一般一個配子體上能產(chǎn)生多個孢子體。將配子體置于添加有40g/L蔗糖和1/4 MS的培養(yǎng)基中培養(yǎng),能抑制性器官的分化,促進(jìn)配子體進(jìn)行無配子生殖高效產(chǎn)生孢子體。一般一個配子體上能產(chǎn)生十幾甚至幾十個孢子體。2.對荷葉鐵線蕨通過有性生殖和無配子生殖產(chǎn)生的孢子體進(jìn)行形態(tài)觀察以及倍性鑒定。發(fā)現(xiàn)孢子體組培苗的新葉形狀、成年植株葉片在掃描電鏡下的紋飾存在差異,是區(qū)分兩種生殖方式的重要特征。利用流式細(xì)胞儀鑒定有性生殖孢子體為二倍體,無配子生殖孢子體為單倍體。從200對SSR引物中篩選出5對能有效區(qū)別兩種孢子體的引物,其中3對可用于構(gòu)建指紋圖譜。3.利用RNA-seq技術(shù)對能夠進(jìn)行無配子生殖高效產(chǎn)生孢子體的配子體進(jìn)行測序,獲得有效數(shù)據(jù)約4Gb,長度大于200bp的Unigene共62198個。利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)對無配子生殖中4個時期的配子體進(jìn)行測序,分別從各個時期鑒定到了20376、20592、22807和19750個基因。采用FDR≤0.001且差異表達(dá)倍數(shù)在2倍以上的條件,在Stage1和Stage2、Stage2和Stage3、Stage3和Stage4之間分別篩選出401、838和669個差異表達(dá)基因。對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析,發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞壁合成和植物激素有關(guān)的代謝途徑可能在無配子生殖過程中起重要作用。此外,從差異表達(dá)基因中鑒定出24個與無配子生殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。利用qRT-PCR研究12個候選基因在不同時期的表達(dá)類型,結(jié)果表明GID1、DELLA、SERK4基因可能在無配子生殖啟動中具有重要作用。4.為了能用qRT-PCR方法在荷葉鐵線蕨不同試驗(yàn)條件下獲得準(zhǔn)確的基因表達(dá)分析結(jié)果,運(yùn)用geNorm、Normfinder和Bestkeeper軟件對10個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評估。結(jié)果表明,40S、UBQ和H3基因適合用作配子體在蔗糖處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)研究;40S和RPL35基因適合用作配子體在赤霉素處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)研究;40S以及RPL35和REF2基因的組合適合配子體不同發(fā)育時期的基因表達(dá)研究。5.對荷葉鐵線蕨有性生殖和無配子生殖總共6個時期的配子體進(jìn)行高通量RNA測序,獲得長度不少于200bp的unigene 264,791條。差異基因表達(dá)分析表明,與有性生殖相比,無配子生殖早期階段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控更為活躍。對兩種生殖方式啟動階段的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG功能富集分析,發(fā)現(xiàn)淀粉與蔗糖代謝途徑和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑只在無配子生殖早期階段顯著富集,進(jìn)一步證明這兩者在無配子生殖啟動過程中的重要作用。篩選出SPS、TPS/TPP、GID1和PP2C等與無配子生殖啟動有關(guān)的基因。6.對性器官分化和無性胚細(xì)胞分化時期的配子體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較研究,以padj0.05作為標(biāo)準(zhǔn),篩選出2466個DEGs,從中鑒定出66個轉(zhuǎn)錄因子,這些轉(zhuǎn)錄因子與被子植物中影響性器官分化的轉(zhuǎn)錄因子是同源的,可能在蕨類植物中與性器官分化有關(guān)。實(shí)時定量試驗(yàn)結(jié)果表明AGL1和BBM基因可能分別具有促進(jìn)蕨類植物性器官和無性胚細(xì)胞分化進(jìn)而進(jìn)行有性生殖和無配子生殖的作用。此外還篩選出22個甲基轉(zhuǎn)移酶基因,說明DNA甲基化可能參與到蕨類植物配子體不同生殖方式的調(diào)控中。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S682.35

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 宋瑩瑩;高晶;戴紹軍;;蕨類植物性別分化對環(huán)境的響應(yīng)[J];生態(tài)學(xué)報(bào);2009年09期

2 張憲春;中國特有和珍稀瀕危蕨類植物[J];植物雜志;2001年04期

本文編號：2736349