【摘要】：較短的綠期是限制日本結(jié)縷草(Zoyisa japonica)進(jìn)一步推廣應(yīng)用的關(guān)鍵,同時(shí)日本結(jié)縷草的基因資源尚未得到有效開發(fā)利用,其葉綠素降解途徑及調(diào)控機(jī)理尚不明確。滯綠基因是調(diào)控葉綠素降解的一類重要基因,在植物衰老和響應(yīng)環(huán)境脅迫中也發(fā)揮著多方面的調(diào)節(jié)作用。本研究的目的旨在從日本結(jié)縷草中分離得到滯綠基因,鑒定其功能,并分析其調(diào)控機(jī)理,進(jìn)而為基因工程育種提供依據(jù)。本研究主要圍繞基因和啟動(dòng)子的克隆、生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)基因過表達(dá)、滯綠突變體恢復(fù)、轉(zhuǎn)基因株系的生理生化分析、啟動(dòng)子活性分析、葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察和RNA-seq測(cè)序分析等方面開展了研究,得到如下研究結(jié)果:1.ZjSGR及其啟動(dòng)子的克隆。利用染色體步移的方法克隆得到ZjSGR的gDNA序列(KP148820)和cDNA序列(KP148819),同時(shí)獲得ZjSGR基因編碼區(qū)上游1029bp的啟動(dòng)子序列。生物信息學(xué)分析表明ZjSGR屬于滯綠基因家族,啟動(dòng)子包含響應(yīng)黑暗和多種激素的順式作用元件。2.ZjSGR的表達(dá)模式分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)分析了 ZjSGR的表達(dá)特征,結(jié)果表明:ZjSGR在日本結(jié)縷草的根、莖、葉中均可表達(dá),但是在葉片中的表達(dá)量最高;ZjSGR可響應(yīng)衰老信號(hào),并且可受黑暗、ABA和MeJA的誘導(dǎo)。3.ZjSGR的亞細(xì)胞定位情況。利用本生煙草瞬時(shí)表達(dá)的方法分析了Zj SGR的亞細(xì)胞定位情況,結(jié)果顯示ZjSGR定位在葉綠體,并且ZjSGR的瞬時(shí)表達(dá)可引起本生煙草葉片黃化。4.轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及表型分析。利用花序侵染法,成功獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。ZjSGR的過表達(dá)可引起野生型擬南芥葉片提早黃化,葉綠素含量下降,光合速率降低,光合系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)下降。5.滯綠突變體nye1-1的恢復(fù)。ZjSGR在擬南芥滯綠突變體nye1-1中的表達(dá)可以恢復(fù)其滯綠表型,說明ZjSGR是AtNYE1的同源基因。6.啟動(dòng)子活性分析。利用轉(zhuǎn)基因擬南芥分析了ZjSGR的啟動(dòng)子活性,結(jié)果表明:ZjSGR的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS可在擬南芥的葉片中高效表達(dá),且在葉脈和毛狀體中有明顯分布;另外,黑暗、ABA和MeJA處理可誘導(dǎo)GUS表達(dá)明顯增強(qiáng)。7.轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察。利用透射電鏡觀察了ZjSGR在瞬時(shí)表達(dá)的本生煙草和穩(wěn)定表達(dá)的擬南芥的葉綠體超微結(jié)構(gòu),結(jié)果表明ZjSGR的過表達(dá)可影響葉綠體正常的發(fā)育,或可影響葉綠體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。8.轉(zhuǎn)基因擬南芥的RNA-seq分析。RNA-seq分析結(jié)果表明ZjSGR加速了轉(zhuǎn)基因擬南芥的衰老,這與ZjSGR對(duì)激素合成、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)有關(guān);ZjSGR除了直接參與到葉綠素降解途徑的反應(yīng)之外,還在植物生長發(fā)育的其他方面發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明ZjSGR是調(diào)控葉綠素降解的一個(gè)重要基因,并可在調(diào)節(jié)植物衰老和生長發(fā)育等其他方面發(fā)揮作用。本研究為更好地理解SGRs的功能、葉綠素降解和衰老調(diào)控機(jī)理提供了依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S688.4;Q943.2
【圖文】：

葉綠素捕獲光能并將其傳遞到光合反應(yīng)的反應(yīng)中心，因此葉綠素及其衍生物在合系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。綠色植物的葉綠素可分為葉綠素ａ和葉綠素ｂ兩種，這兩葉綠素的合成途徑目前己經(jīng)研宄明確（Ｔａｎａｋａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００７）。簡(jiǎn)要來說，葉綠素ａ（Ｃｈｉ邋ａ）逡逑由５－氨基乙酰丙酸經(jīng)過一系列的復(fù)雜反應(yīng)合成；在Ｃｈｉ邋ａ合成的最后一步，部分７－羥基葉綠素ａ邋（７－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ邋ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ邋ａ）在脫植基葉綠素加氧酶（ＣＡＯ）的作下轉(zhuǎn)化為葉綠素ｂ邋（Ｃｈｉ邋ｂ）。Ｃｈｉ邋ｂ在葉綠素ｂ還原酶（ＣＢＲ）和７－羥甲基葉綠素ａ還酶（ＨＣＡＲ）的作用下轉(zhuǎn)化為Ｃｈｌａ（Ｍｅｇｕｒｏｅｔａｌ．，２０１１）。研宄表明擬南芥中含有ＮＹＣｌ和ＮＯＬ這兩種ＣＢＲ（Ｈｏｒｉｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００９）。Ｃｈｉ邋ａ和Ｃｈｉ邋ｂ相互轉(zhuǎn)化的這…過程稱為葉綠素環(huán)，參與葉綠素合成和葉綠素循環(huán)的酶己全部分離鑒定，葉綠素循環(huán)途徑己經(jīng)明確因?yàn)椋茫瑁殄澹忭毥?jīng)過葉綠素循環(huán)轉(zhuǎn)化為Ｃｈｉ邋ａ之后才能進(jìn)行下一步的代謝途徑，所以葉素循環(huán)對(duì)于葉綠素降解途徑來說必不可少（Ｈ６ｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ，邋２００６）。逡逑１．５．４葉綠素降解途徑逡逑葉綠素降解是氮素循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在保護(hù)細(xì)胞免受損傷方面也有重要的作用如果對(duì)葉綠素降解的調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，那么會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的光敏損傷，并引發(fā)細(xì)胞凋（Ｈ６ｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１）。根據(jù)反應(yīng)發(fā)生部位之小Ｎ，葉綠素降解途徑大致分為兩

圖１－３葉綠素降解途徑（Ｃｈｅｎ邋ｅｔａｌ．，邋２０１６）逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑．５滯綠基因的其它功能逡逑研宄表明ＳＧＲ除直接調(diào)控葉綠素降解之外，在植物衰老和其他生理代謝方面也著重要的作用。Ｚｈｏｕ邋ｅｔａｌ．邋（２０１１）的研究表明ＭＳＧ７？調(diào)節(jié)葉片衰老并參與根瘤進(jìn)程（Ｚｈｏｕ邋ｅｔａｌ．，邋２０１１）。的表達(dá)量在大多數(shù)器官中維持在較低的水平，但片衰老階段明顯升高。ＭＳＧ／？在根瘤中的表達(dá)量經(jīng)Ｎ０３的誘導(dǎo)升高了８倍。逡逑調(diào)節(jié)乙烯受體基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并且與ＰＳＹ１基因互作在色素形成及果實(shí)成熟中起到關(guān)鍵的作用（Ｌｕｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１３）。價(jià)可調(diào)節(jié)一的基因來調(diào)控蕓薯的生長發(fā)育和對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力，并且還可以影響油脂的（Ｑｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１６）。因此，有必要通過進(jìn)一步的研宄來探索雙Ｍ在植物生長發(fā)育理代謝和對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)等其他方面的功能（Ｃｈｅｎ邋ｅｔａｌ．，邋２０１６）。逡逑７本研究的目的及內(nèi)容逡逑．１研究目的逡逑

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本文編號(hào)：2734944