【摘要】：完全甜柿(簡稱“甜柿”)果實(shí)成熟后在樹上自然脫澀,無需處理即可鮮食,且方便貯運(yùn)、貨架期長,是目前柿產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)發(fā)展的品種類型,也是遺傳改良的重要目標(biāo)。與日本甜柿自然脫澀受隱性基因控制有別,中國甜柿自然脫澀性狀受顯性單基因位點(diǎn)控制,因而在完全甜柿的遺傳改良中具有重要的應(yīng)用前景,但其關(guān)鍵基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不完全清楚。本研究基于RNA-seq和iTRAQ技術(shù)對中國甜柿‘鄂柿1號’花后10周(此期日本甜柿自然脫澀,而中國甜柿和非完全甜柿尚未脫澀)、20周(此期中國甜柿自然脫澀而非完全甜柿尚未脫澀)和花后10周溫水(40℃·12 h)脫澀處理及對照(室溫放置,25℃·12 h)果實(shí)進(jìn)行差異基因和差異蛋白分析,篩選到一批與柿果脫澀相關(guān)的候選基因。在此基礎(chǔ)上,對其中差異表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步篩選獲得了一個(gè)參與中國甜柿自然脫澀的關(guān)鍵基因DkMYB14,并解析了其在自然脫澀中的作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.轉(zhuǎn)錄組組裝及差異表達(dá)基因和差異表達(dá)蛋白鑒定。轉(zhuǎn)錄組組裝獲得非冗余Unigene 135,999條,總長166,861,433 nt,平均長度為1,227 nt,N50達(dá)到了2,071 bp。其中3,818個(gè)Unigenes在自然脫澀過程中差異表達(dá),15,597個(gè)Unigenes在溫水脫澀處理前后差異表達(dá)。通過iTRAQ技術(shù)共鑒定出4,954個(gè)蛋白,其中3,041個(gè)蛋白被2段以上不同肽段覆蓋(61.37%),篩選獲得523個(gè)差異表達(dá)蛋白。2.差異表達(dá)基因和差異表達(dá)蛋白功能分析。自然脫澀過程中,上調(diào)基因主要與糖代謝、果實(shí)色澤、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及乙烯響應(yīng)有關(guān);溫水脫澀處理過程中,上調(diào)基因主要與糖酵解、丙酮酸代謝以及熱激應(yīng)答有關(guān);兩個(gè)脫澀過程中的下調(diào)表達(dá)基因均涉及廣泛的生物學(xué)過程,如催化活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及次生物質(zhì)代謝等。在自然脫澀和溫水脫澀兩個(gè)過程中分別有228和633個(gè)Unigenes共同上調(diào)和下調(diào)表達(dá);其中共同上調(diào)表達(dá)的228個(gè)基因主要與糖代謝有關(guān);共同下調(diào)表達(dá)的633個(gè)基因主要與類黃酮、花青素代謝及激素調(diào)節(jié)有關(guān)。乙醛代謝相關(guān)基因在溫水脫澀處理和自然脫澀過程中顯著上調(diào)表達(dá),但在溫水處理中更劇烈;同時(shí),與柿單寧生物合成相關(guān)的基因/蛋白在兩個(gè)脫澀過程中均顯著下調(diào)表達(dá)。在自然脫澀過程中,分別有95和65個(gè)Unigenes和其對應(yīng)的蛋白共同上調(diào)和下調(diào)表達(dá),其中65個(gè)共同下調(diào)的基因/蛋白主要與柿單寧生物合成相關(guān),而共同上調(diào)的95個(gè)基因/蛋白則主要與糖代謝過程有關(guān)。在溫水處理脫澀過程中分別有54和51個(gè)基因與其對應(yīng)的蛋白共同上調(diào)和下調(diào)表達(dá),其中51個(gè)共同下調(diào)的基因/蛋白質(zhì)主要與莽草酸代謝過程有關(guān),而共同上調(diào)的54個(gè)基因/蛋白則主要與熱激響應(yīng)有關(guān)。在自然脫澀和溫水脫澀過程中分別鑒定出43和136個(gè)特異上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,20和122個(gè)特異下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,其中10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,包括4個(gè)ERF、3個(gè)NAC、2個(gè)WRKY和1個(gè)Zinc finger共同上調(diào)表達(dá),16個(gè)轉(zhuǎn)錄因子包括2個(gè)bHLH、1個(gè)bZIP、3個(gè)ERF、2個(gè)WRKY和8個(gè)Zinc finger共同下調(diào)表達(dá)。此外,ERF、MYB、NAC、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子在自然脫澀過程中大量表達(dá)。3.DkMYB14功能鑒定及作用機(jī)制解析�；谵D(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測序分析結(jié)果,進(jìn)一步對在自然脫澀中差異表達(dá)的7個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了功能鑒定。通過RACE技術(shù)獲得其基因全長(依次命名為DkMYB14-20)。多重比較分析表明,僅DkMYB16為R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子,其余均屬于R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子。系統(tǒng)進(jìn)化分析將7個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子歸類到不同的分支,其中DkMYB14與其他苯丙烷生物合成抑制基因聚為一個(gè)分支,屬M(fèi)YB亞家族4亞組,在C2區(qū)域中存在一個(gè)EAR類似轉(zhuǎn)錄抑制基序LxLxI。DkMYB14定位于細(xì)胞核,其在7個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子中表達(dá)水平最高,且在中國甜柿自然脫澀關(guān)鍵時(shí)期(花后15-20周)特異上調(diào)表達(dá),與中國甜柿可溶性及不溶性單寧累積模式相關(guān),初步確定DkMYB14為候選的關(guān)鍵基因。在柿葉片中瞬時(shí)超表達(dá)DkMYB14導(dǎo)致可溶性單寧含量顯著降低,同時(shí)不溶性單寧含量增加;相反,干涉表達(dá)DkMYB14后可溶性單寧含量顯著增加。進(jìn)一步在擬南芥中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化DkMYB14同樣使可溶性單寧顯著降低,不溶性單寧增加。qRT-PCR表達(dá)分析表明,DkMYB14抑制單寧生物合成途徑基因的表達(dá),同時(shí),促進(jìn)與可溶性單寧凝固相關(guān)基因ADH1和PDC2的表達(dá),其基因表達(dá)水平與可溶性和不溶性單寧含量的變化一致。結(jié)合酵母單雜交和雙熒光素酶分析實(shí)驗(yàn),證明了DkMYB14可以直接抑制單寧生物合成特異基因DkANR和DkF3'5'H的表達(dá),同時(shí)能激活DkADH1和DkPDC2的表達(dá),從而導(dǎo)致可溶性單寧的降低。啟動子分段實(shí)驗(yàn)表明,5'-TTTAGTTA-3'基序?yàn)镈kMYB14在DkPDC2啟動子上的核心結(jié)合元件。最后,在柿果圓片上瞬時(shí)超表達(dá)DkMYB14,獲得了與柿葉片瞬時(shí)超表達(dá)及擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化相同的結(jié)果,進(jìn)一步證明了DkMYB14是調(diào)控中國甜柿自然脫澀的關(guān)鍵基因。綜上所述,本研究通過全基因組篩選獲得一批在柿果脫澀過程中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因,其中DkMYB14為首次發(fā)現(xiàn)的調(diào)控中國甜柿自然脫澀的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因,該基因的發(fā)現(xiàn)對完全甜柿的分子育種和遺傳改良具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S665.2
【圖文】：

圖 1-1 不同脫澀類型柿品種分類（根據(jù) Akagi et al 2011，有修改）Classification of different astringent types of persimmon cultivars modified fret al (2011)

圖 1-2 柿單寧結(jié)構(gòu)（Matsuo and Ito 1978）Fig. 1-2 The chemical structure of persimmon-tannin (Matsuo and Ito 1978)Yonemori et al（1983）以不同發(fā)育時(shí)期的日本甜柿和非完全甜柿果實(shí)為試材，分析了兩種柿果單寧成分組成及含量的動態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)兒茶素和沒食子酸為柿單寧

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 羅正榮,李發(fā)芳,蔡禮鴻;部分中國原產(chǎn)甜柿種質(zhì)的分子系統(tǒng)學(xué)研究[J];園藝學(xué)報(bào);1999年05期

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王燕;中國原產(chǎn)完全甜柿自然脫澀機(jī)理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 熊雅樓;中國甜柿‘鄂柿1號’自然和40℃溫水脫澀前后差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號：2734383