【摘要】：葡萄是世界上重要的栽培果樹之一,歐洲葡萄品種因其優(yōu)質(zhì)與高產(chǎn)的特性被廣泛用于釀酒、鮮食及制汁、制干。歐洲葡萄突出缺點是抗病抗逆性差,尤其易感白粉病。研究表明,葡萄中的芪類物質(zhì)白藜蘆醇既有植保素的抑菌作用,又有助于人體健康。中國是葡萄三大起源中心之一,蘊藏著豐富的抗性資源與抗性基因。中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’不僅抗病性強而且白藜蘆醇含量高,但是其白藜蘆醇代謝調(diào)控途徑研究并不清楚。本研究以毛葡萄‘丹鳳-2’為材料,以歐洲葡萄品種‘赤霞珠’為對照,通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組多組學(xué)聯(lián)用,從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平分析‘丹鳳-2’白藜蘆醇含量高的遺傳機制,挖掘調(diào)控白藜蘆醇合成的相關(guān)基因,為進一步解析白藜蘆醇代謝調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。取得主要結(jié)果如下:1、轉(zhuǎn)錄組測序表明其中丹鳳-2表達(dá)基因數(shù)目為19,008個,赤霞珠表達(dá)基因數(shù)目為19,373個�！P-2’存在54條芪合成酶基因,而‘赤霞珠’中為48條。其中,‘丹鳳-2’存在6條特異芪合成酶轉(zhuǎn)錄本。通過對‘丹鳳-2’和‘赤霞珠’的果實在四個發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組測序分析,獲得兩者在各個發(fā)育時期的差異表達(dá)基因,使用GO富集,KEGG富集以及MapMan分析差異表達(dá)基因參與的代謝通路及生物學(xué)過程,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)色期和成熟期差異表達(dá)代謝途徑主要為苯丙氨酸代謝途徑,光合途徑,細(xì)胞壁組分代謝以及脂肪酸代謝途徑;并且在苯丙氨酸代謝途徑中,芪合成酶基因和苯丙氨酸解氨酶基因在‘丹鳳-2’中高表達(dá),而在‘赤霞珠’中,查爾酮合成酶基因高表達(dá)。除芪類代謝相關(guān)基因外,還發(fā)現(xiàn)生物脅迫基因、抗病基因、轉(zhuǎn)錄因子基因、光合基因、脂肪代謝基因、細(xì)胞壁組分有關(guān)基因和木質(zhì)素基因等差異表達(dá)基因,在‘丹鳳-2’和‘赤霞珠’中表達(dá)增強基因數(shù)目分別為:72個/116個,46個/70個,179個/150個,50個/1個,66個/62個,26個/91個以及14個/24個�！P-2’在轉(zhuǎn)錄因子基因增強表達(dá)基因數(shù)目明顯多于‘赤霞珠’,預(yù)示‘丹鳳-2’在轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)代謝途徑強于‘赤霞珠’。2、蛋白質(zhì)組測序得到3,751個蛋白質(zhì),包括細(xì)胞過程(1,180個),發(fā)育過程(198個),生長(4個),免疫系統(tǒng)過程(26個),細(xì)胞和組織互作(120個),定位(181個),代謝過程(269個),調(diào)節(jié)(355個),再生(1個),脅迫應(yīng)答(544個)和其它(227個)。通過蛋白質(zhì)組分析‘丹鳳-2’和‘赤霞珠’果實在四個發(fā)育時期差異表達(dá)的蛋白,發(fā)現(xiàn)芪合成酶和查爾酮合成酶在次生代謝途徑中競爭底物香豆酰輔酶A,在‘丹鳳-2’果實發(fā)育的轉(zhuǎn)色期和成熟期,芪合成酶和芪類物質(zhì)合成生物學(xué)過程得到增強。3、通過代謝組分析‘丹鳳-2’和‘赤霞珠’在果實發(fā)育四個時期差異積累的代謝物質(zhì),共鑒定到203種物質(zhì),其中,‘丹鳳-2’中芪合成酶和查爾酮合成酶的上游物質(zhì)包括苯丙氨酸、羥基肉桂酸積累量高于‘赤霞珠’。采用高效液相色譜方法檢測‘丹鳳-2’和‘赤霞珠’果實在硬果期、轉(zhuǎn)色前期、轉(zhuǎn)色期和成熟期中白藜蘆醇及云杉新苷的含量,發(fā)現(xiàn)‘丹鳳-2’在各發(fā)育時期芪類物質(zhì)含量均高于‘赤霞珠’。并且在‘丹鳳-2’果實成熟期白藜蘆醇及云杉新苷含量最高。同時,對‘丹鳳-2’和‘赤霞珠’果實在四個發(fā)育時期黃酮類物質(zhì)和花青苷物質(zhì)含量進行測定,發(fā)現(xiàn)‘赤霞珠’果實中黃酮類物質(zhì)和花青苷類物質(zhì)整體含量顯著高于‘丹鳳-2’。4、以白藜蘆醇為底物,在氧甲基轉(zhuǎn)移酶,漆酶和白藜蘆醇糖基轉(zhuǎn)移酶催化下分別生成紫檀芪,葡萄素和云杉新苷。用全基因組分析苯丙氨酸代謝途中與白藜蘆醇衍生物合成相關(guān)的基因家族,鑒定到58條氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因,77條漆酶基因和49條白藜蘆醇糖基轉(zhuǎn)移酶基因。通過聚類、基因結(jié)構(gòu)與基因保守模體的分析,發(fā)現(xiàn)葡萄白藜蘆醇衍生物代謝基因家族成員存在功能冗余和功能分化,并且具有時空表達(dá)差異,其中三類基因在‘丹鳳-2’表達(dá)水平均高于‘赤霞珠’。5、芪合成酶基因表達(dá)受6類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。通過共表達(dá)分析篩選調(diào)控芪合成酶基因的轉(zhuǎn)錄因子,鑒定到52個候選正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,包括6個bHLH,2個bZIP,19個ERF,16個MYB,8個WRKY和1個NAC基因;同時鑒定到3個候選負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,分別為1個bHLH,1個MYB和1個bZIP基因。其中,‘丹鳳-2’中有5個bHLH,1個bZIP,16個ERF,12個MYB,8個WRKY和1個NAC基因共計43個轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達(dá),而‘赤霞珠’中只有9個轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達(dá)。進一步酵母單雜交實驗驗證,結(jié)果表明12個得分最高的候選轉(zhuǎn)錄因子中11個轉(zhuǎn)錄因子與芪合成酶基因啟動子結(jié)合。此外,我們初步研究了一個與擬南芥脫落酸合成調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子ATAF1同源的轉(zhuǎn)錄因子VqNAC1的功能。結(jié)果表明葡萄葉片中瞬時表達(dá)VqNAC1促進芪類物質(zhì)積累,并且增加了脫落酸合成相關(guān)基因以及PR1基因的表達(dá)。6、在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的1,112條長鏈非編碼RNA進行了共表達(dá)分析,篩選到4條參與調(diào)控芪合成酶基因的候選長鏈非編碼RNA;通過實驗研究發(fā)現(xiàn)其中的2條長鏈非編碼RNA可以上調(diào)芪合成酶基因表達(dá)。綜上所述,經(jīng)過多組學(xué)分析兩個材料在各個發(fā)育時期的差異表達(dá),使用GO富集,KEGG富集以及MapMan分析差異表達(dá)基因參與的代謝通路及生物學(xué)過程,揭示了在果實發(fā)育過程中芪合成酶基因的表達(dá)與芪類物質(zhì)產(chǎn)物累積的內(nèi)在因素與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系;發(fā)現(xiàn)了芪合成酶基因的表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用,特別是在‘丹鳳-2’中鑒定到6個特異芪合成酶轉(zhuǎn)錄本以及2個參與調(diào)芪合成酶基因表達(dá)的長鏈非編碼RNA的新發(fā)現(xiàn),這些基因數(shù)據(jù)信息為今后系統(tǒng)研究與利用中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’的芪合成酶基因及其調(diào)控表達(dá)功能,與歐洲葡萄品種雜交,提高抗病性與芪類物質(zhì)含量的育種提供了科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S663.1
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述冗余還是參與不同的生物學(xué)過程仍待研究 (Parage et al. 2012; Richter 芪合成酶和查爾酮合成酶在氨基酸序列上有 75%-90%的相似性，已有研成酶從查爾酮合成酶進化而來 (Tropf et al. 1994)。特別是 1997 年美國《科道，葡萄漿果中含有對人體抗癌抗衰老的功能成分白藜蘆醇。在人體代謝，白藜蘆醇被人體吸收后轉(zhuǎn)化成云杉新苷由血漿蛋白、脂蛋白攜運至各組人體保健有重要作用。在植物體內(nèi)，白藜蘆醇是一種天然植保素，對植物有抑制作用。此外，白藜蘆醇存在三類衍生物，紫檀芪，葡萄素和云杉新究報道，紫檀芪和葡萄素可以抑制真菌孢子萌發(fā)。而白藜蘆醇，紫檀芪，杉新苷統(tǒng)稱為芪類物質(zhì)，后三者為白藜蘆醇衍生物。

20圖 3-1 兩個葡萄材料果實四個發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組測序分析（A）兩個材料果實四個發(fā)育時期的果實性狀。中上半部分為丹鳳-2 果實四個發(fā)育階段性狀和形態(tài)，分別為硬果期（花后 25 天）、轉(zhuǎn)色前期（花后 40 天）、轉(zhuǎn)色期（花后 50 天）和成熟期（花后 80 天）；下半部分為赤霞珠果實四個發(fā)育時期性狀和形態(tài)，分別為硬果期（花后 30 天）、轉(zhuǎn)色前期（花后 45 天）、轉(zhuǎn)色期（花后 60 天）和成熟期（花后 110 天）。（B）兩個材料果實四個發(fā)育時期中表達(dá)基因數(shù)目以及表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目。其中丹鳳-2 表達(dá)基因數(shù)目為 19,008 個，赤霞珠表達(dá)基因數(shù)目為 19,373 個。（總基因數(shù)目）葡萄中總基因數(shù)目為 29,927 個。（C）兩個材料果

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4 匡明}

本文編號：2734347