【摘要】：蠟梅(Chimonanthus praecox L.),花開于冬季,在我國已有上千年的栽培歷史。蠟梅整朵花的顏色基本是由黃色或者淡黃色的中被片顏色決定的,鮮有其它顏色的報道。目前對蠟梅花色素的研究主要集中在不同蠟梅品種花色素物質(zhì)的鑒定上。雖然蠟梅花色素在不同品種中略有差異,不過主要色素物質(zhì)為類黃酮類化合物。作為園林植物,蠟梅的花色性狀是一種重要觀賞性狀,挖掘類黃酮生物合成相關(guān)基因并對其分子調(diào)控機理進行研究,具有十分重要的理論價值和應用前景。本課題以紅心蠟梅和素心蠟梅為研究對象,基于相應的轉(zhuǎn)錄組與蛋白組數(shù)據(jù)庫信息,篩選類黃酮合成相關(guān)基因,并對與花青素合成有重要作用的花青素合成酶基因CpANS1和轉(zhuǎn)錄因子CpMYB2的功能與作用機理進行探究。本課題主要包括三個部分,第一部分為紅心蠟梅和素心蠟梅類黃酮合成相關(guān)基因的篩選;第二部分為CpANS1基因的克隆和功能研究;第三部分為CpMYB2基因的克隆以及相關(guān)分析。主要研究結(jié)果如下:1.蠟梅花被片中類黃酮合成相關(guān)基因的獲得通過構(gòu)建紅心蠟梅H29和素心蠟梅H64不同花發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫以及H29盛花期的蛋白組數(shù)據(jù)庫,分離得到134條unigene和30條蛋白序列。結(jié)合H29和H64花被片中色素的構(gòu)成,推導出蠟梅花被片的中類黃酮化合物的生物合成途徑。通過對以上2個品種中類黃酮合成相關(guān)基因的表達分析,ANS基因的表達對花青素生物合成具有重要的作用,同時蠟梅花被片中黃酮醇合成酶FLS和花青素合成酶AVS1的不存在競爭性表達。2.花青素合成酶基因CpANS1的克隆與功能分析利用實時熒光定量PCR實驗CpANS1基因的表達量進行分析,CpANS1在素心蠟梅中表達量極低,能夠?qū)涿{迫進行響應。將CpANS1基因構(gòu)建超量表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥tds4-2突變體,轉(zhuǎn)基因突變體恢復種皮顏色,并在莖和果莢上有明顯花青素積累。超表達CpANS1顯著提高擬南芥花青素和原花青素的合成能力,上述結(jié)果表明CpANS1基因在植物體中具有催化底物白花矢車菊素生成花青素的能力。3.轉(zhuǎn)錄因子CpMYB2的克隆與功能分析CpMYB2基因為R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子,屬于與MYB基因家族的S6亞族。對CpMYB2基因的表達量進行分析發(fā)現(xiàn)其表達模式與CpANS1一致。通過雙熒光素酶實驗分析,CpMYB2基因能輕微的激活CpANS1的啟動子活性。CpMYB2蛋白具有很強的轉(zhuǎn)錄活性,并且轉(zhuǎn)錄激活域位于C端。利用酵母雙雜交實驗證明CpMYB2可以與CpbHLH1和CpbHLH2發(fā)生互作,并且CpMTB2與CpbHLH2共表達時,能夠提高CpANS1的啟動子活性。在全國87個蠟梅品種中,檢測到CpMYB2基因的6種變異類型(CpMYB2a/b/c/d/e/f),這些變異的產(chǎn)生大部分是由于3堿基重復(GGA)位點數(shù)量差異導致的,而CpMYB2f變異型是由于CpMYB2基因編碼區(qū)C端4堿基AAAG的缺失突變導致的。目前調(diào)查的素心蠟梅品種的CpMYB2位點都是等位基因CpMYB2ff。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S685.99
【圖文】：

反應被代謝生成４－香豆酰輔酶（４－Ｃｏｕｍａｒｏｙｌ－ＣｏＡ）。隨后類黃酮生物合成途徑第１個逡逑合成酶，查爾酮合成酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＨＳ）以丙二酰輔酶和４－香豆酰輔酶為底逡逑物催化生成查爾酮（圖１．２）。在ＣＨＳ之后，一系列異構(gòu)酶、還原酶、羥化酶、糖基轉(zhuǎn)逡逑移酶和�；D(zhuǎn)移酶組合出現(xiàn)，修飾類黃酮化合物的基本骨架，形成多種類黃酮化學亞逡逑類。其中黃酮醇３－輕化酶（Ｆｌａｖａｎｏｎｅ３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｆ３Ｈ）氧化中心環(huán)生成二氫黃酮逡逑醇，隨后黃酮醇－３’－輕化酶（Ｆｌａｖａｎｏｉｄ３’－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｆ３’Ｈ）或黃酮醇３’５’輕化酶逡逑（Ｆｌａｖａｎｏｉｄ３’５’－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｆ３’５’Ｈ）可在Ｂ環(huán)的３’或５’位置羥基化，分別生成二氫逡逑３逡逑

ｎｉｄｉｎ）和無色飛燕草素（Ｌｅｕｃｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）。二氫黃酮醇還可以直接天竺葵素（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）的前體�；ㄇ嗨睾铣擅福ǎ粒睿簦瑁铮悖幔睿椋铄澹螅睿簦璐呋陨希撤N不同類型的無色底物生成相應的花青素類物質(zhì)，隨后同位點的糖基化、�；⒓谆揎椇�，經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Ｇｌｕｔａｅ，ＧＳＴ）和特定轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運并儲存至液泡，最終形成穩(wěn)定而可見的花中，參與類黃酮生物合成途徑的基因和相應的功能己經(jīng)被大量報道，例如擬南芥，玉米，矮牽牛和金魚草等，基于模式植物中對色素合有大量關(guān)于園藝花卉品種的色素合成酶基因的研宄報道，例如芍藥，紅山茶（Ｗａｎｇｅｔａｌ２０１４），金花茶（Ｚｈｏｕｅｔａｌ２０１７）等。對于花色模式己在許多獨特顏色的花中得到研究，例如，在芍藥屬中（尸Ｃ／／／和基因的共同表達導致了滇牡丹的黃色色２０１５）。相比之下，在芍藥（尸／沉增ｆｏｒａ）中，黃色花瓣是由于／ＭＬ、、３Ｇ：Ｔ和基因表達量的減少導致的（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ２０１４）。這表明因的表達模式是具有種屬特異性的，不同的基因表達模式會導致花而影響植物具有不同的色澤。逡逑

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本文編號：2726928