發(fā)布時間：2020-06-21 22:50

【摘要】：花青苷是葡萄中很重要的次生代謝產(chǎn)物,是紅葡萄酒中主要的呈色物質(zhì),對紅葡萄酒的顏色起著決定性作用,同時花色苷還可與其他物質(zhì)(如單寧)結合,進而影響葡萄酒的口感,從而對葡萄酒的品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。目前,葡萄果皮中不同種類花青苷對光照強度的響應機制還不清楚,完全遮光時花青素的合成及調(diào)控基因表達模式還不明晰。本研究以釀酒葡萄‘馬瑟蘭’為試材,采用4種不同透光性(A:50%;B:15%;C:5%;D:0)的果袋對花后45d的果穗進行套袋,以不套袋果穗作為對照(CK)。分別在花后90d(S1)、花后100d(S2)和花后125d(S3)取樣,采用GC-MS、LC-MS及RNA-seq技術對不同時期的樣品進行了測定和分析。主要結果如下:1.遮光果實中總酚和花青素含量顯著降低,果袋透光率小于50%時單寧和類黃酮物質(zhì)的合成被顯著抑制;套袋增加了果實中酒石酸、蘋果酸和乳酸含量,并在S3時和對照差異最大。不同處理影響果實中香氣物質(zhì)的合成與積累,隨光照強度的減弱,成熟果實中脂肪酸代謝和異戊二烯代謝途徑合成的芳香物質(zhì)種類和總量減少;D減少了氨基酸代謝合成的芳香物質(zhì)種類,其他處理和CK一致,芳香物質(zhì)總量在遮光果實中顯著降低。除庚醇、順式-7-癸醛和反式-己烯醛含量在遮光果實中顯著增加外,其余芳香物質(zhì)在果實遮光后含量降低。2.轉錄組測序結果顯示,在S2時,隨果袋透光率的減小,下調(diào)的基因從502個增加到1482個,上調(diào)基因從721個增加到2308個;在S3時,隨著光照強度的降低,下調(diào)基因從1592個增加到2429個,上調(diào)基因從1326個增加到1599個。GO富集結果顯示,在生物學過程分類中,上下調(diào)基因數(shù)目最多的生物學過程為代謝過程、細胞過程、單一生物過程和刺激響應;細胞組分分類中差異基因數(shù)最多的是細胞區(qū)域、細胞、膜相關和細胞器;分子功能分類中上下調(diào)基因數(shù)量最多的是催化活性和結合。KEGG富集結果表明,不同處理差異表達基因主要參與類黃酮合成、植物晝夜節(jié)律、芪類、二芳基庚醇和姜醇的生物合成及苯丙氨酸代謝等通路。挑選類黃酮和脂肪酸代謝途徑中的14個候選基因進行q RT-PCR分析,結果顯示,除PAL(VIT_08s0040g01710)在A1中表達水平的變化趨勢和轉錄組數(shù)據(jù)不一致外,其他基因均和轉錄組測序數(shù)據(jù)結果一致。3.果袋透光率減小,延遲了果實的轉色時間。A和CK的果實幾乎同時開始轉色,B的著色時間比CK晚3d,C和D處理延遲了10d;果實總花青素濃度在3個發(fā)育階段均隨果實袋透光率的降低而降低,其中A、B、C和D在采收期分別比CK下降10.10%、19.23%、37.07%和51.50%。采用UHPLC-MS/MS在CK和D在成熟果皮中分別檢測到24種和21種花青苷組分,Malvidin-3-O-coumaroylglucoside(trans)含量隨光照強度的增加而增加,完全遮光時不能合成,屬于光誘導型花青苷類型;其它花青苷的含量與光照強度變化無顯著的相關性,Malvidin-3-O-coumaroylglucoside(cis)和Malvidin-3-O-acetylglucoside在完全遮光果皮中分別占總花青苷含量的14%和34%,對照果皮中分別占總花青苷含量的1%和27%,是非光誘導型花青苷的典型代表。光誘導型和非光誘導型花青苷的合成通過類黃酮合成途徑中的功能基因及MYB、bHLH等轉錄因子進行調(diào)控。4.對葡萄bHLH基因家族成員進行生物信息學和不同生育期果實中的表達水平進行了分析。葡萄b HLH中的96個成員被分成了6個亞族,外顯子數(shù)目在1-11個之間,第Ⅴ亞族外顯子數(shù)目總體較多,第Ⅲ亞族成員外顯子數(shù)目較少;葡萄b HLH家族分布于除9號染色體之外的其他所有染色體上,氨基酸數(shù)目在136-573個之間,分子量大小范圍為15249.69D至64156.59D,等電點在4.65至10.37之間,除GSVIVT01034621001外均為疏水性蛋白;大多數(shù)VvbHLH家族成員主要定位于細胞核中,二級結構以無規(guī)則卷曲為主;芯片數(shù)據(jù)分析表明,該家族成員在不同生育期及不同組織的表達具有特異性,大多數(shù)基因在果實轉色開始后表達上調(diào)。qRT-PCR表明,‘馬瑟蘭’葡萄在轉色期VvbHLH家族成員表達水平上調(diào)顯著。5.克隆得到了葡萄VvMYB30、VvbHLH79和VvbHLH121并成功構建了過表達載體。農(nóng)桿菌介導的蘋果果皮瞬時表達分析發(fā)現(xiàn),注射轉化農(nóng)桿菌的蘋果果皮在光照條件下能夠著色,花青苷含量增加,黑暗時果皮不能著色。q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)著色部位果皮中Vv MYB30、Vvb HLH79、Vvb HLH121和花青苷合成相關功能基因(CHS、CHI、F3H、DFR、LDOX和F3’5’H)的表達水平不同程度上調(diào)。洋蔥表皮亞細胞定位發(fā)現(xiàn),3個基因均定位于細胞核中,與生物信息學預測結果一致。
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S663.1
【圖文】：

圖 1-1 花青苷的生物合成途徑Figure 1-1 Biosynthetic pathways of anthocyanins2.2 花青苷的修飾花青素的糖基化修飾通常是由定位在細胞質(zhì)的糖基轉移酶來催化的，最常見的和花青素結合的單糖依次是葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖。C3端的糖基化過程發(fā)生在所有自然合成的花青素上，以此增加色素的穩(wěn)定性（Mazza et al., 1987）。糖基化使花青苷的顏色向紅色轉變，花青素 3-生物苷中的普通糖有蘆丁糖（葡萄糖加鼠李糖）、苦參糖（葡萄糖加葡萄糖）和桑樹糖（葡萄糖加木糖）（Bego a et al., 1999；Ka¨hko¨nen et al., 2003），3-生物苷通常比花青素單苷更穩(wěn)定（Luo et al., 2007）。糖基轉移酶 1 家族能夠將糖殘基加入花青素不同位置，花青素中 3，5 二糖苷也是比較常見的，與花青苷苷元相比，3 位糖基化顯著提高了花青素苷元的穩(wěn)定性，而 5 位糖基化苷元可能降低花青素的穩(wěn)定性

圖 2-1 GC-MS 總離子質(zhì)譜圖Figure 2-1Total ion mass spectrogram of GC-MS1.4 數(shù)據(jù)處理用 Origin 9.0 軟件對數(shù)據(jù)進行整理和作圖，用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用最小顯著差異法（LSD）比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，顯著性水平設定為 α=0.05。2 結果與分析2.1 光照強度對葡萄果實單寧、多酚、類黃酮及花青素含量的影響不同果袋對果實中單寧含量的影響如圖 2-2a 所示，套袋果實中單寧物質(zhì)含量與對照相比顯著下降。S1 和 S2 時，A 處理果實中單寧物質(zhì)含量與 CK 無顯著差異，隨果袋透光率的減弱，果實中單寧含量下降，B、C 和 D 處理差異顯著，S2 時果實中單寧含量增加。S3 時，果實中的單寧物質(zhì)含量和 S2 時差異不大，

本文編號：2724766