【摘要】：花青苷是葡萄中很重要的次生代謝產(chǎn)物,是紅葡萄酒中主要的呈色物質(zhì),對(duì)紅葡萄酒的顏色起著決定性作用,同時(shí)花色苷還可與其他物質(zhì)(如單寧)結(jié)合,進(jìn)而影響葡萄酒的口感,從而對(duì)葡萄酒的品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。目前,葡萄果皮中不同種類花青苷對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng)機(jī)制還不清楚,完全遮光時(shí)花青素的合成及調(diào)控基因表達(dá)模式還不明晰。本研究以釀酒葡萄‘馬瑟蘭’為試材,采用4種不同透光性(A:50%;B:15%;C:5%;D:0)的果袋對(duì)花后45d的果穗進(jìn)行套袋,以不套袋果穗作為對(duì)照(CK)。分別在花后90d(S1)、花后100d(S2)和花后125d(S3)取樣,采用GC-MS、LC-MS及RNA-seq技術(shù)對(duì)不同時(shí)期的樣品進(jìn)行了測定和分析。主要結(jié)果如下:1.遮光果實(shí)中總酚和花青素含量顯著降低,果袋透光率小于50%時(shí)單寧和類黃酮物質(zhì)的合成被顯著抑制;套袋增加了果實(shí)中酒石酸、蘋果酸和乳酸含量,并在S3時(shí)和對(duì)照差異最大。不同處理影響果實(shí)中香氣物質(zhì)的合成與積累,隨光照強(qiáng)度的減弱,成熟果實(shí)中脂肪酸代謝和異戊二烯代謝途徑合成的芳香物質(zhì)種類和總量減少;D減少了氨基酸代謝合成的芳香物質(zhì)種類,其他處理和CK一致,芳香物質(zhì)總量在遮光果實(shí)中顯著降低。除庚醇、順式-7-癸醛和反式-己烯醛含量在遮光果實(shí)中顯著增加外,其余芳香物質(zhì)在果實(shí)遮光后含量降低。2.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,在S2時(shí),隨果袋透光率的減小,下調(diào)的基因從502個(gè)增加到1482個(gè),上調(diào)基因從721個(gè)增加到2308個(gè);在S3時(shí),隨著光照強(qiáng)度的降低,下調(diào)基因從1592個(gè)增加到2429個(gè),上調(diào)基因從1326個(gè)增加到1599個(gè)。GO富集結(jié)果顯示,在生物學(xué)過程分類中,上下調(diào)基因數(shù)目最多的生物學(xué)過程為代謝過程、細(xì)胞過程、單一生物過程和刺激響應(yīng);細(xì)胞組分分類中差異基因數(shù)最多的是細(xì)胞區(qū)域、細(xì)胞、膜相關(guān)和細(xì)胞器;分子功能分類中上下調(diào)基因數(shù)量最多的是催化活性和結(jié)合。KEGG富集結(jié)果表明,不同處理差異表達(dá)基因主要參與類黃酮合成、植物晝夜節(jié)律、芪類、二芳基庚醇和姜醇的生物合成及苯丙氨酸代謝等通路。挑選類黃酮和脂肪酸代謝途徑中的14個(gè)候選基因進(jìn)行q RT-PCR分析,結(jié)果顯示,除PAL(VIT_08s0040g01710)在A1中表達(dá)水平的變化趨勢和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致外,其他基因均和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果一致。3.果袋透光率減小,延遲了果實(shí)的轉(zhuǎn)色時(shí)間。A和CK的果實(shí)幾乎同時(shí)開始轉(zhuǎn)色,B的著色時(shí)間比CK晚3d,C和D處理延遲了10d;果實(shí)總花青素濃度在3個(gè)發(fā)育階段均隨果實(shí)袋透光率的降低而降低,其中A、B、C和D在采收期分別比CK下降10.10%、19.23%、37.07%和51.50%。采用UHPLC-MS/MS在CK和D在成熟果皮中分別檢測到24種和21種花青苷組分,Malvidin-3-O-coumaroylglucoside(trans)含量隨光照強(qiáng)度的增加而增加,完全遮光時(shí)不能合成,屬于光誘導(dǎo)型花青苷類型;其它花青苷的含量與光照強(qiáng)度變化無顯著的相關(guān)性,Malvidin-3-O-coumaroylglucoside(cis)和Malvidin-3-O-acetylglucoside在完全遮光果皮中分別占總花青苷含量的14%和34%,對(duì)照果皮中分別占總花青苷含量的1%和27%,是非光誘導(dǎo)型花青苷的典型代表。光誘導(dǎo)型和非光誘導(dǎo)型花青苷的合成通過類黃酮合成途徑中的功能基因及MYB、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控。4.對(duì)葡萄bHLH基因家族成員進(jìn)行生物信息學(xué)和不同生育期果實(shí)中的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。葡萄b HLH中的96個(gè)成員被分成了6個(gè)亞族,外顯子數(shù)目在1-11個(gè)之間,第Ⅴ亞族外顯子數(shù)目總體較多,第Ⅲ亞族成員外顯子數(shù)目較少;葡萄b HLH家族分布于除9號(hào)染色體之外的其他所有染色體上,氨基酸數(shù)目在136-573個(gè)之間,分子量大小范圍為15249.69D至64156.59D,等電點(diǎn)在4.65至10.37之間,除GSVIVT01034621001外均為疏水性蛋白;大多數(shù)VvbHLH家族成員主要定位于細(xì)胞核中,二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主;芯片數(shù)據(jù)分析表明,該家族成員在不同生育期及不同組織的表達(dá)具有特異性,大多數(shù)基因在果實(shí)轉(zhuǎn)色開始后表達(dá)上調(diào)。qRT-PCR表明,‘馬瑟蘭’葡萄在轉(zhuǎn)色期VvbHLH家族成員表達(dá)水平上調(diào)顯著。5.克隆得到了葡萄VvMYB30、VvbHLH79和VvbHLH121并成功構(gòu)建了過表達(dá)載體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋果果皮瞬時(shí)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),注射轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的蘋果果皮在光照條件下能夠著色,花青苷含量增加,黑暗時(shí)果皮不能著色。q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)著色部位果皮中Vv MYB30、Vvb HLH79、Vvb HLH121和花青苷合成相關(guān)功能基因(CHS、CHI、F3H、DFR、LDOX和F3’5’H)的表達(dá)水平不同程度上調(diào)。洋蔥表皮亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),3個(gè)基因均定位于細(xì)胞核中,與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果一致。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S663.1
【圖文】：

圖 1-1 花青苷的生物合成途徑Figure 1-1 Biosynthetic pathways of anthocyanins2.2 花青苷的修飾花青素的糖基化修飾通常是由定位在細(xì)胞質(zhì)的糖基轉(zhuǎn)移酶來催化的，最常見的和花青素結(jié)合的單糖依次是葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖。C3端的糖基化過程發(fā)生在所有自然合成的花青素上，以此增加色素的穩(wěn)定性（Mazza et al., 1987）。糖基化使花青苷的顏色向紅色轉(zhuǎn)變，花青素 3-生物苷中的普通糖有蘆丁糖（葡萄糖加鼠李糖）、苦參糖（葡萄糖加葡萄糖）和桑樹糖（葡萄糖加木糖）（Bego a et al., 1999；Ka¨hko¨nen et al., 2003），3-生物苷通常比花青素單苷更穩(wěn)定（Luo et al., 2007）。糖基轉(zhuǎn)移酶 1 家族能夠?qū)⑻菤埢尤牖ㄇ嗨夭煌恢茫ㄇ嗨刂?3，5 二糖苷也是比較常見的，與花青苷苷元相比，3 位糖基化顯著提高了花青素苷元的穩(wěn)定性，而 5 位糖基化苷元可能降低花青素的穩(wěn)定性

圖 2-1 GC-MS 總離子質(zhì)譜圖Figure 2-1Total ion mass spectrogram of GC-MS1.4 數(shù)據(jù)處理用 Origin 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著差異法（LSD）比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，顯著性水平設(shè)定為 α=0.05。2 結(jié)果與分析2.1 光照強(qiáng)度對(duì)葡萄果實(shí)單寧、多酚、類黃酮及花青素含量的影響不同果袋對(duì)果實(shí)中單寧含量的影響如圖 2-2a 所示，套袋果實(shí)中單寧物質(zhì)含量與對(duì)照相比顯著下降。S1 和 S2 時(shí)，A 處理果實(shí)中單寧物質(zhì)含量與 CK 無顯著差異，隨果袋透光率的減弱，果實(shí)中單寧含量下降，B、C 和 D 處理差異顯著，S2 時(shí)果實(shí)中單寧含量增加。S3 時(shí)，果實(shí)中的單寧物質(zhì)含量和 S2 時(shí)差異不大，

本文編號(hào)：2724766