【摘要】：類胡蘿卜素組分和含量的變異是導(dǎo)致柑橘果實(shí)色澤多樣性的主要原因。紅色果皮的柑橘品種因其“喜慶”的艷麗色澤一直深受消費(fèi)者的喜愛,因此也是柑橘果實(shí)外觀品質(zhì)遺傳改良的一個(gè)重要育種目標(biāo)。但是柑橘新品種的常規(guī)選育過程存在成本高,效率低,周期長等諸多限制,因此闡明柑橘果皮類胡蘿卜素多態(tài)性及色澤形成的遺傳機(jī)制,并鑒定出與果皮紅色性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種顯得尤為重要。基于此,本研究結(jié)合遺傳學(xué)、多組學(xué)、自然群體關(guān)聯(lián)分析、代謝研究和轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證等多種方法鑒定了柑橘果皮紅色性狀形成的主效基因及其關(guān)鍵遺傳變異位點(diǎn),并解析了柑橘紅色果皮中C_(30)脫輔基類胡蘿卜素種屬特異演化的分子進(jìn)化機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.基于SLAF簡化基因組測序的紅橘×枳高密度遺傳圖譜的構(gòu)建利用簡化基因組測序SLAF-seq技術(shù)對紅橘和枳F_1雙假測交雜交群體的94個(gè)雜交子代和親本進(jìn)行深度測序,開發(fā)了3,817個(gè)高質(zhì)量的SLAF分子標(biāo)記,并構(gòu)建了紅橘(Citrus reticulata)x枳(Poncirus trifoliata)雜交群體9個(gè)連鎖群的雙親整合高密度遺傳圖譜。該遺傳圖譜分子標(biāo)記在染色體上分布較均勻,且基因組覆蓋度較完整,總圖距1,502.44 cM,平均圖距為0.42cM。本研究構(gòu)建的紅橘×枳雜交群體高密度遺傳圖譜將為后續(xù)紅橘優(yōu)良的果實(shí)品質(zhì)性狀(如紅色果皮性狀)和枳的優(yōu)良砧木性狀的QTL定位和遺傳育種研究奠定重要的基礎(chǔ)。2.果皮紅色性狀形成的類胡蘿卜素代謝基礎(chǔ)本研究結(jié)合半制備液相分離純化和質(zhì)譜鑒定了紅色果皮中含量較高的C_(30)脫輔基類胡蘿卜素β-檸烏素(m/z 433.3[M+H]~+,C_(30)H_(40)O_2)和β-citraurinene(m/z 419.3[M+H]~+,C_(30)H_(42)O)。利用紅橘×枳雜交群體和柑橘自然群體進(jìn)行果皮色差值和類胡蘿卜素組分含量的關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)C_(30)脫輔基類胡蘿卜素占總類胡蘿卜素的比例與柑橘果皮紅色性狀正相關(guān)系數(shù)最高(r0.9,P-value=2.2E-16)。此外與柑橘果皮紅色性狀負(fù)相關(guān)系數(shù)最高的為葉黃素和玉米黃質(zhì)。這些結(jié)果說明柑橘果皮是一個(gè)由多種類胡蘿卜素組分共同影響的復(fù)雜性狀,而其中C_(30)脫輔基類胡蘿卜素對果皮紅色性狀的影響最大。3.柑橘果皮紅色性狀的BSA分析,精細(xì)定位和候選基因的鎖定本研究首先利用紅橘(紅皮果)和枳(黃皮果)雜交子代混池RNA-seq測序產(chǎn)生的SNP進(jìn)行BSA分析,將果皮紅色性狀定位在第8號染色體。再用CAPs標(biāo)記、SLAF-seq開發(fā)的SNP標(biāo)記和交換單株進(jìn)行精細(xì)定位,將區(qū)段縮小到了約1.3Mb的區(qū)間(Chr 8:16707807~18021439)。該區(qū)間包含CCD4b基因座。紅黃果皮混池RNA-seq分析表明CCD4b在紅果皮子代混池中的表達(dá)量是黃果皮的30多倍。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果也證實(shí)了紅皮雜交子代果皮CCD4b基因表達(dá)量都高于黃果皮雜交子代。其中親本紅橘的CCD4b基因啟動(dòng)子序列距離起始密碼子1537bp處有一個(gè)Harbinger類型158bp MITE轉(zhuǎn)座子的插入,且MITE序列上的SNP1~G和SNP2~G與雜交子代紅色果皮性狀共分離,表明CCD4b很可能是紅橘×枳雜交群體果皮紅色性狀形成的候選基因。4.果皮類胡蘿卜素含量的QTL定位本研究通過構(gòu)建的紅橘×枳高密度遺傳圖譜,對群體12個(gè)類胡蘿卜素性狀進(jìn)行代謝物mQTL定位。兩年的QTL定位共有19個(gè)重疊的mQTL位點(diǎn)。其中8個(gè)QTL在第八號連鎖群的56.2~89.0 CM的區(qū)間重疊。這個(gè)區(qū)間能夠解釋β-檸烏素,β-citraurinene,玉米黃質(zhì),葉黃素,黃體黃質(zhì),八氫番茄紅素,六氫番茄紅素和C_(30)脫輔基類胡蘿卜素在雜交群體中的變異。這些性狀中C_(30)脫輔基類胡蘿卜素與總類胡蘿卜素的比例在這個(gè)區(qū)間具有最高的LOD值(LOD≈36)和表型貢獻(xiàn)率(PVE≈91%)。這個(gè)區(qū)間在克里曼丁基因組中的物理位置為Chr 8:17664105...18572910,與上述紅黃果皮性狀精細(xì)定位的區(qū)間Chr 8:16707807~18021439重疊,且重疊區(qū)域包含果皮紅色性狀的候選基因CCD4b,表明CCD4b位點(diǎn)可能是控制群體中C_(30)脫輔基類胡蘿卜素和部分C_(40)類胡蘿卜素含量變異,進(jìn)而導(dǎo)致紅/黃果皮性狀多態(tài)性的關(guān)鍵遺傳因素。5.候選基因CCD4b的功能驗(yàn)證本研究利用原核表達(dá)證實(shí)了柑橘CCD4b能夠降解玉米黃質(zhì)產(chǎn)生紅色的C_(30)脫輔基類胡蘿卜素β-檸烏素。此外利用多基因代謝工程愈傷證實(shí)了超表達(dá)CCD4b能夠在愈傷中產(chǎn)生果皮特有的C_(30)脫輔基類胡蘿卜素β-citraurinene,說明CCD4b是控制C_(30)脫輔基類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵基因。超量表達(dá)CCD4b也會(huì)導(dǎo)致β-胡蘿卜素、葉黃素、紫黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)含量顯著下降。這些結(jié)果能夠與上述類胡蘿卜素mQTL結(jié)果相互印證,說明CCD4b不僅是C_(30)脫輔基類胡蘿卜素變異的主效基因,同時(shí)也是雜交群體中C_(40)類胡蘿卜素多態(tài)性的關(guān)鍵遺傳因子。本研究通過原生質(zhì)體共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CCD4b和擬南芥FBN1a基因共定位,說明CCD4b可能定位在質(zhì)體小球中,其降解功能可能也發(fā)生在質(zhì)體小球中。與之相互印證的是,超表達(dá)CCD4b的愈傷導(dǎo)致質(zhì)體小球的數(shù)量和總面積顯著增加,說明轉(zhuǎn)基因愈傷中類胡蘿卜素組分和含量的劇烈變化也引起了細(xì)胞亞細(xì)胞器的適應(yīng)性重構(gòu)。6.CCD4b基因表達(dá)的等位多態(tài)性的分子機(jī)理紅橘×枳雜交群體和柑橘自然群體中,CCD4b的表達(dá)量在與紅色性狀高度關(guān)聯(lián)。通過雜交群體表達(dá)量的eQTL分析表明,CCD4b基因的一個(gè)順式eQTL位點(diǎn)與雜交子代果皮紅色性狀共分離。自然群體115份材料關(guān)聯(lián)分析結(jié)果也表明CCD4b啟動(dòng)子區(qū)域MITE轉(zhuǎn)座子序列中的SNP2~G(CAACTG)的G堿基與紅色果皮性狀緊密連鎖,并與CCD4b的高表達(dá)量和C_(30)脫輔基類胡蘿卜素的含量高度正相關(guān)。高分辨率熔解曲線(HRM)實(shí)驗(yàn)和等位基因cDNA的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明CCD4b基因的表達(dá)存在等位差異,其中在MITE轉(zhuǎn)座子序列中含有SNP2~G(CAACTG)的等位基因?qū)?yīng)的CCD4b表達(dá)量高于其它等位基因。此外煙草瞬時(shí)表達(dá)雙熒光素酶和GUS酶活性檢測實(shí)驗(yàn)也證實(shí)SNP2~G(CAACTG)能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子活性。7.柑橘紅色果皮中C_(30)脫輔基類胡蘿卜素種屬特異演化的分子機(jī)理CCD4b啟動(dòng)子序列的進(jìn)化樹分析表明CCD4b啟動(dòng)子區(qū)域的MITE插入事件和MITE序列中SNP2~G的形成發(fā)生在寬皮橘這個(gè)種形成之后,與之相對應(yīng)的是,只有紅色果皮的寬皮橘及其雜交種的CCD4b基因高表達(dá),且積累大量C_(30)的脫輔基類胡蘿卜素。柑橘有五個(gè)CCD4亞家族成員,其中大部分成員都與具有可以降解類胡蘿卜素產(chǎn)生C_(27)脫輔基類胡蘿卜素功能的其它植物CCD4基因聚在一起,但是CCD4b卻與它們處在不同的進(jìn)化枝中,暗示CCD4b基因是在柑橘CCD4基因亞家族復(fù)制進(jìn)化的事件中產(chǎn)生了功能分化。此外栽培、野生和原始柑橘的CCD4b關(guān)鍵功能域的氨基酸序列很保守,說明CCD4b基因的功能分化事件可能發(fā)生在柑橘形成早期,而寬皮橘形成之后,順式調(diào)控區(qū)序列的變異導(dǎo)致了CCD4b表達(dá)量在紅色果皮的寬皮橘中急劇提高,進(jìn)而導(dǎo)致了C_(30)脫輔基類胡蘿卜素僅在紅色果皮的寬皮橘及其雜交種中大量積累的種屬特異演化。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S666
【圖文】：

7 1-1 園藝植物類胡蘿卜素的主要代謝通路 （圖片引用于 Yuan et al 2015）前體物質(zhì)的縮寫：IPP 異戊烯二磷酸；DMAPP 二甲基烯丙基二磷酸；GGPP基焦磷酸。類胡蘿卜素代謝路徑基因的縮寫：IPI 異戊烯焦二磷酸異構(gòu)酶；GGP兒基焦磷酸合成酶；PSY 八氫番茄紅素合成酶；PDS 八氫番茄紅素脫氫酶；Z構(gòu)酶；ZDS ζ-胡蘿卜素脫氫酶；CRTISO 類胡蘿卜素異構(gòu)酶；LCYE 番茄紅素B 番茄紅素β-環(huán)化酶；CHYB β-羥化酶；CYP97C 細(xì)胞色素 P450 單加氧酶 97C氧化酶；VDE 紫黃質(zhì)脫氧環(huán)氧化酶；CCS 辣椒紅素合成酶；NXS 新黃質(zhì)合成蘿卜素裂解雙加氧酶；NCED 9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶。1 General carotenoid metabolic pathway in horticultural crops（Yuan et al 2015viations of precursor of carotenoids: IPP, isopentenyl diphosphate; DMAPP, dimete; GGPP, geranylgeranyl diphosphate. The abbreviations of carotenoid pathway gen

柑橘果皮紅色性狀形成的生化基礎(chǔ)及分子遺傳機(jī)制 Stewart, 1973)。果皮的類胡蘿卜素的組成比果肉更復(fù)雜，因此果皮類胡蘿卜素液譜的分離相對于果肉而言更困難。比如β-檸烏素和紫黃質(zhì)以及β-citraurinene 和質(zhì)的色譜峰很難區(qū)分開，導(dǎo)致很多柑橘果皮類胡蘿卜素的研究并沒有在紅色柑皮中檢測到β-檸烏素和β-citraurinene 物質(zhì)(Liu et al 2007; Matsumoto et al 2007)。是僅在柑橘中報(bào)道的 C30脫輔基類胡蘿卜素β-citraurinene，容易與β-隱黃質(zhì)LC 峰重疊，且液相質(zhì)譜離子響應(yīng)弱(CURL, 1965; Leuenberger and Stewart, 1976tsumoto et al 2007)，很難在混合類胡蘿卜素粗品中鑒定。因此柑橘研究中往往容略這些物質(zhì)的存在，不利于果皮類胡蘿卜素的準(zhǔn)確定性定量。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳力耕,陳克玲,李俊,胡運(yùn)權(quán);柑桔果皮色澤遺傳的研究[J];園藝學(xué)報(bào);1993年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 盧素文;柑橘番茄紅素β-環(huán)化酶基因功能分析及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 劉升銳;柑橘高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及落葉性狀的QTL定位[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 曾文芳;甜橙八氫番茄紅素合成酶基因及其啟動(dòng)子的克隆與功能分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

4 曹洪波;轉(zhuǎn)基因調(diào)控柑橘類胡蘿卜素積累的細(xì)胞學(xué)和代謝研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 劉慶;‘暗柳’甜橙紅色突變體性狀形成的分子機(jī)理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

6 程運(yùn)江;柑橘體細(xì)胞胞質(zhì)遺傳及葉綠體SSR引物開發(fā)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

7 徐娟;幾個(gè)柑桔產(chǎn)區(qū)果實(shí)色澤評價(jià)及紅肉臍橙（Citrus sinensis L.cv.Cara cara）果肉呈色機(jī)理初探[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

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1 胡益波;枳遺傳多樣性及其與紅橘雜交后代遺傳研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2724656