【摘要】：發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizgones)侵染植物后,可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根。菠菜(Spinacia oleracea L.)是常見的食用蔬菜,目前尚未有菠菜毛狀根的研究報(bào)道。本研究篩選到適合誘導(dǎo)菠菜毛狀根的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株LBA9402。結(jié)果表明,LBA9402侵染菠菜外植體莖后,毛狀根的誘導(dǎo)率最高可達(dá)16%。菠菜毛狀根呈白色,具有豐富的根毛,能在無外源激素的固體培養(yǎng)基上快速增殖生長。通過誘導(dǎo)菠菜毛狀根產(chǎn)生愈傷并進(jìn)行分化,獲得了菠菜毛狀根的再生株。此外,本研究實(shí)現(xiàn)了發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒與攜帶外源GFP基因的Ti質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化,PCR結(jié)果和熒光顯微鏡觀察顯示,發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的rol B基因以及Ti質(zhì)粒中GFP基因已在菠菜毛狀根基因組中穩(wěn)定表達(dá)。CRISPR/Cas9是一種基因組高效定點(diǎn)突變的工具,已廣泛應(yīng)用于模式植物和各種作物。盡管菠菜的基因組序列被公布,但CRISPR/Cas9技術(shù)尚未成功地應(yīng)用于菠菜。在上面研究的基礎(chǔ)上,我們以菠菜的毛狀根為研究對(duì)象,使用CRISPR/Cas9精確編輯兩個(gè)類纖維素合成酶 D 基因(Cellulose Synthase-Like D genes CSLD),Spo2331和Spo10340,探究其參與菠菜毛狀根根毛形成的機(jī)制。結(jié)果表明,CRISPR/as9可在菠菜中形成四種突變類型,即置換,插入,刪除和組合突變,其中刪除突變所占比重最高,約占64.1%。每個(gè)靶位點(diǎn)之間的突變率具有很大差異。15個(gè)Sp02331獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因毛狀根系中,有7個(gè)是純合或雙等位基因突變根系,其他8個(gè)是雜合突變根系,所有純合突變根系顯示出根毛膨脹和變短的表型,與擬南芥csld2突變體的表型特征相似。獲得的15個(gè)Spo10340獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因發(fā)根系中,有13個(gè)雜合突變系根系,但沒有獲得純合或雙等位基因突變根系,所有雜合突變根系與正常毛狀根無明顯差別。菠菜CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立為菠菜的功能基因的鑒定以及菠菜的分子育種奠定了基礎(chǔ),在菠菜的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究領(lǐng)域均具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S636.1
【圖文】：

改造而來的。將ｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｐ３５ｓ－Ｂ邋（基因號(hào)：ＡＩ１３３７２９．１）中的５似１切割位點(diǎn)片逡逑段和ＣＣＤＢ替換為包含一個(gè)ＡｔＵ３ｂ邋ｓｎＲＮＡ啟動(dòng)子和兩個(gè)新的Ｉ切割位點(diǎn)的序列逡逑（圖２Ａ）。從ｐＹＬｓｇＲＮＡ－ＡｔＵ３ｂ邋（基因號(hào)：ＫＲ０２９０９７．１）擴(kuò)增ＡｔＵ３ｂ啟動(dòng)子序列。然后逡逑根據(jù)Ｍａ（Ｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１６）和Ｘｉｅ（Ｘｉｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１６）的方法具體步驟如下：從包含ｔＲＮＡ和逡逑ｓｇＲＮＡ序列的ｐＧＴＲ載體中擴(kuò)X椘危ㄒ鐨蛄腥綾恚玻此荊�，染忬将改X斕牡腦靨邋義希ǜ腦斕模穡伲蹋茫遙桑櫻校遙茫幔螅瑰澹常擔(dān)螅攏┖屠┰銎位旌�，lMａ邋Ｉ酶切和Ｔ４連接反應(yīng)一步法逡逑連接合成（圖２Ｂ）。逡逑一步法連接反應(yīng)體系：也ａ邋Ｉ邋（購于ＮＥＢ公司）１５邋Ｕ，１０ｘ５ａｓ邋Ｉ邋ｂｕｆｆｅｒ邋１．５邋｜ｘＬ，Ｔ４連逡逑接酶５０邋Ｕ，載體０．５明，目的膠回收片段３０邋ｍｇ，去離子水補(bǔ)齊１５隊(duì)反應(yīng)總體系。一逡逑步法連接ＰＣＲ程序：３７邋°Ｃ酶切１０邋ｍｉｎ，邋１０邋°Ｃ連接５邋ｍｉｎ，２０°Ｃ延伸１０邋ｍｉｎ，３個(gè)循逡逑環(huán)，３７邋°Ｃ酶切１０邋ｍｉｎ，１０邋°Ｃ連接５邋ｍｉｎ，２０邋°Ｃ延伸１０邋ｍｉｎ，１０個(gè)循環(huán)，程序結(jié)束后逡逑４邋°Ｃ保存于冰箱備用。逡逑１５逡逑

２００８）。為了得到菠菜毛狀根的最適生長培養(yǎng)基，將ＬＢＡ９４０２誘導(dǎo)的菠菜毛狀根，分別置逡逑于固體和液體兩種培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。對(duì)整個(gè)培養(yǎng)過程持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，菠菜毛狀根在液逡逑體培養(yǎng)基中生長緩慢（圖３－３Ｄ），甚至出現(xiàn)了褐化的現(xiàn)象（圖３－３Ｇ）。而固體培養(yǎng)基上繼代逡逑的毛狀根生長旺盛（圖３－３Ｂ）。對(duì)２種培養(yǎng)條件下生長的毛狀根進(jìn)行稱重，在培養(yǎng)了邋２１邋ｄ后逡逑固體培養(yǎng)基上的毛狀根鮮重的增長倍數(shù)高于液體培養(yǎng)基４４倍（圖３－３Ｅ）。將液體培液中生逡逑長的毛狀根取出，吸干水分后繼續(xù)在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，毛狀根又可恢復(fù)生長，長出健逡逑康的毛狀根分支。逡逑２１逡逑

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6 王子艷;杜e

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