【摘要】：香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴�；�(Fusarium oxysporum f.sp. cubense,Foc)引起的一種典型土傳真菌性病害,隨著病害的不斷蔓延,造成病害面積不斷擴(kuò)大,已經(jīng)嚴(yán)重威脅到我國香蕉種植的正常生產(chǎn)。香蕉枯萎病菌腐生能力極強(qiáng),在土壤中可以長期生存,目前仍沒有找到非常有效的防治方法,利用生物防治、土壤處理以及輪作等措施,效果均不理想,培育抗枯品種是解決香蕉枯萎病的根本途徑之一。真菌小RNA (MicroRNA-lIke RNAs,milRNAs)是真菌中存在的一類非編碼小分子RNA,不僅能夠誘導(dǎo)基因沉默,還能通過RNAi路徑抑制寄主植物的免疫系統(tǒng),在真菌致病機(jī)理及植物免疫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)合長期對香蕉枯萎病菌的研究,利用Solexa測序技術(shù),對Focl孢子、Foc1菌絲、Foc4孢子和Foc4菌絲四個(gè)樣品進(jìn)行測序和分析,挖掘候選小RNAs,采用煙草瞬時(shí)表達(dá)方法提高香蕉枯萎病菌中低豐度表達(dá)milRNAs的表達(dá)量,并且通過Northern雜交技術(shù)對候選milRNAs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,將為深入研究Foc侵染相關(guān)milRNAs在Foc侵染過程中的生物學(xué)功能奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),對后續(xù)開展以milRNAs作為RNAi基因沉默靶標(biāo)的轉(zhuǎn)基因抗枯品系培育具有重要意義。主要研究結(jié)果如下:1.利用Solexa高通量測序技術(shù),對香蕉枯萎病菌Foc1孢子、Foc1菌絲、Foc4孢子和Foc4菌絲4個(gè)樣品進(jìn)行深度測序,共挖掘到小分子RNA序列數(shù)為93204898條,4個(gè)樣品中小分子RNAs的序列數(shù)量及堿基數(shù)量分布的差異不顯著;不同樣品在測序整體上的一致性較好,表明測序數(shù)據(jù)具有較高可靠性,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析;4個(gè)樣品的小RNAs數(shù)量和種類數(shù)量分別在所有小分子RNAs總數(shù)和種類數(shù)中所占比例均為最低,測序預(yù)測到的候選milRNA序列長度分布以19-25 nt為主要類型;4個(gè)樣品中長度在19-22 nt之間的milRNAs,其首位點(diǎn)堿基均對U的偏好性最高,小RNAs在2-4號位的堿基分布中U含量極少,第10位堿基對A的偏好性極高。2.通過與數(shù)據(jù)庫的比對,共預(yù)測到354個(gè)候選小RNAs,其中221個(gè)為已知的候選小RNAs,包括133個(gè)植物中已知的小RNAs和88個(gè)真菌中已知的小RNAs, 133個(gè)為新的候選小RNAs;各種小RNAs在4個(gè)樣品中存在差異,表明小RNA可能參與香蕉枯萎病菌不同生理小種及各生長階段的調(diào)控。利用miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetFinder,354個(gè)候選小RNAs共預(yù)測得到2186個(gè)靶基因。4個(gè)樣品小RNA的靶基因GO功能分類中,以規(guī)類到生物過程的靶基因數(shù)量最多。共有1261個(gè)靶基因被注釋到214個(gè)KEGG代謝路徑中,其中1193個(gè)靶基因被注釋到新陳代謝路徑中,在代謝過程中通過調(diào)控氨基酸、各種酶以及次級代謝產(chǎn)物等路徑,從而實(shí)現(xiàn)對真菌整體的生長調(diào)控。3.采用Northern雜交技術(shù),驗(yàn)證了香蕉枯萎病菌中確實(shí)存在著20個(gè)小RNA,其中2個(gè)為高豐度表達(dá)小RNA,可以直接采用Northern雜交進(jìn)行驗(yàn)證,其余18個(gè)小RNA為低豐度表達(dá)小RNA,不能直接采用Northern雜交進(jìn)行驗(yàn)證,但可以利用煙草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù),提高其在煙草中的表達(dá)量,然后可采用Northern雜交進(jìn)行驗(yàn)證。鑒定出的20個(gè)小RNA中,16個(gè)為已知的小RNA,其余4個(gè)為新發(fā)現(xiàn)小 RNA,分別為 novel-milR16、novel-milR31、novel-milR19、novel-milR168。后續(xù)工作將對剩余的300多個(gè)候選小RNA進(jìn)行鑒定,以及對這20個(gè)小RNA開展功能分析。 【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.68

【圖文】：

海南大學(xué)碩±學(xué)位論文逡逑３N３樣品中各類小分子ＲＮＡｓ的分布逡逑Ｆｏｃｌ－、Ｆｏｃｌ＋、Ｆｏｃ４－和Ｆｏｃ４＋中小分子ＲＮＡ的分布如圖３－７所示。從圖３－７－Ａ逡逑可Ｗ發(fā)現(xiàn)ｒＲＮＡ總數(shù)和種類數(shù)量分別為１６５３２９８５和１７０７２５，，其中ｒＲＮＡ的數(shù)量逡逑在Ｆｏｃｉ－的小分子ＲＮＡ總數(shù)中所占比例為７７．４９％，ｒＲＮＡ的種類數(shù)所占比例為逡逑１７．２％；邋ｍｉＲＮＡ總數(shù)和種類數(shù)量分別為１４８５和１０９，ｍｉＲＮＡ在Ｆｏｃｉ－的小分子逡逑ＲＮＡ總數(shù)和種類數(shù)中所占比例分別為０．００６９％和化０１１％。逡逑圖３－７－Ｂ可Ｗ找出ｒＲＮＡ總數(shù)和種類數(shù)分別為１５２６０１５７和１８７８２８，其中逡逑ｒＲＮＡ的數(shù)量在Ｆｏｃｌ＋的小分子ＲＮＡ總數(shù)中所占比例為６８．８６％，ｒＲＮＡ的種類逡逑數(shù)所占比例為１０．９％；邋ｍｉＲＮＡ總數(shù)和種類數(shù)量分別為１９１３和１６６，邋ｍｉＲＮＡ的數(shù)逡逑量在Ｆｏｃｌ＋的小分子ＲＮＡ總數(shù)中所占比例為０．００８６％，ｍｉＲＮＡ的種類數(shù)所占比逡逑例為邋０．００９６％。逡逑圖３－７－Ｃ可Ｗ找出ｒＲＮＡ總數(shù)和種類數(shù)分別為１６９３３８６９和１８２５１１

圖３－８候選�。遥危粒箦义希裕幔猓欤邋澹常稿澹茫幔睿洌椋洌幔簦邋澹螅恚幔欤戾澹遥危粒箦义�

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2712380