【摘要】：柑橘植物的根、莖、葉、花、果實以及種子中富含多種類黃酮類次生代謝產(chǎn)物,對人類具有重要的保健功能。目前對柑橘類黃酮生物合成的遺傳調(diào)控研究較少,對類黃酮生物合成量有明顯影響的關(guān)鍵基因也鮮有報道。查爾酮合成酶CHS(Chalcone synthase)是類黃酮生物合成途徑上游的關(guān)鍵酶,對類黃酮的產(chǎn)量有重要影響。本學(xué)位論文重點(diǎn)研究柑橘中CHS基因的遺傳多樣性及其對類黃酮產(chǎn)量的影響,鑒定了新的CHS功能基因,研究了其表達(dá)調(diào)控機(jī)制及對類黃酮生物合成的作用。利用UPLC檢測了37份柑橘種質(zhì)中的11種類黃酮成分,分析了其種類與含量在不同遺傳背景下的分布特征;從10份類黃酮含量差異顯著的種質(zhì)中克隆了CitCHS2基因,研究了其遺傳多樣性及其表達(dá)與類黃酮含量的關(guān)系;利用同源序列比對從柑橘基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到77條CHS相似序列,通過聚類分析篩選到10個CHS候選基因,通過對不同處理條件下各基因的表達(dá)模式進(jìn)行研究,明確了CHS在柑橘中是家族基因及其主要功能成員,并發(fā)現(xiàn)了一個新的CHS基因。通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?對2個功能成員影響類黃酮產(chǎn)量的作用進(jìn)行了功能鑒定,對新的CHS基因進(jìn)行了基因功能驗證,基本明確了3個CHS基因?qū)︻慄S酮生物合成的調(diào)控影響。獲得的主要結(jié)果如下:1、柑橘類黃酮的時空分布UPLC分析結(jié)果顯示,37份柑橘種質(zhì)生理成熟期果皮中類黃酮的含量有較大的變化,種質(zhì)間的總黃酮含量變化范圍為1,918.51~17,037.80 mgkg~(-1)鮮重,除金彈中總黃酮含量低于2,000 mgkg~(-1)鮮重外,其余36份種質(zhì)的總黃酮含量均超過3,000 mgkg~(-1)鮮重,其中代代酸橙果皮中總黃酮含量最高,與金彈相比,兩者相差近8倍。通過聚類分析可以清楚地看出,類黃酮含量有明顯的種質(zhì)特異性,特別是寬皮桔類和橙類等種質(zhì)的聚類結(jié)果與遺傳親緣關(guān)系的分類結(jié)果基本一致。相同組織在不同的發(fā)育時期,總黃酮含量明顯不同,而且不同種質(zhì)間總黃酮含量的變化趨勢差異顯著;不同組織間的總黃酮含量也有非常大的差異,同一種質(zhì)不同組織部位的類黃酮含量由高至低依次為幼果、嫩葉、幼莖、主莖和根,表現(xiàn)出顯著的組織特異性。2、CitCHS2基因的遺傳多樣性從5份高類黃酮含量的種質(zhì)(枳柚、巴西酸橙、塔羅科血橙、粉紅湯姆遜葡萄柚和莽山大坑野桔),5份低類黃酮含量的種質(zhì)(北京檸檬、宜昌橙、梁平柚、澳指檬雜柑和廣西憑祥土檸檬)中,分別克隆了CitCHS2基因序列(GenBank Accession No.:KP720583~720592)。結(jié)果顯示:CitCHS2基因的基本結(jié)構(gòu)由一個內(nèi)含子和兩個外顯子組成,內(nèi)含子長度為102 bp,與cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)其剪接位點(diǎn)不符合5'-GT…AG-3'的剪接方式,該內(nèi)含子為非Ⅱ型剪接內(nèi)含子,PolyA尾端起始于1385 bp處。CitCHS2基因的cDNA全長1313 bp,包含1,173 bp開放閱讀框,編碼391個氨基酸。10份種質(zhì)的CitCHS2基因高度保守,共只在15個核苷酸位點(diǎn)上有差異并導(dǎo)致7個氨基酸位點(diǎn)(site 1~7)的改變。10份種質(zhì)中的CHS蛋白均為疏水蛋白且均無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽,其分子量介于42,592.1~42,636.1 Da之間,等電點(diǎn)介于6.28~6.47之間,不穩(wěn)定系數(shù)介于34.25~35.95之間。對來自10份柑橘種質(zhì)的CHS的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)有4個變異的氨基酸位點(diǎn)(site1(16~18 bp)、site2(442~444 bp)、site5(961~963 bp)和site7(1060~1062 bp))出現(xiàn)在α螺旋上,另外3個均不在任何結(jié)構(gòu)域上。3、CitCHS2基因的表達(dá)及其對類黃酮含量的影響CitCHS2基因的表達(dá)具明顯的組織特異性。檢測了10份柑橘種質(zhì)的葉片中CitCHS2基因的表達(dá)特征,除巴西酸橙外,其余種質(zhì)幼嫩葉片中CitCHS2的表達(dá)水平顯著高于成熟葉片。同一種質(zhì)的不同組織中,CitCHS2基因的表達(dá)水平由高到低依次為幼果、嫩葉、幼莖、主莖韌皮部和根。北京檸檬、塔羅科血橙和廣西憑祥土檸檬的果實在6個不同發(fā)育時期,CitCHS2基因的表達(dá)水平表現(xiàn)出先降低后變化趨勢波動不明顯。類黃酮含量的檢測結(jié)果顯示,CitCHS2基因的表達(dá)水平與類黃酮含量的變化趨勢一致。同一種質(zhì)嫩葉中的類黃酮含量高于成熟葉片。相關(guān)性分析顯示,在成熟葉片中CitCHS2基因的表達(dá)與類黃酮含量之間的相關(guān)性較小(R0.5),在嫩葉中兩者表現(xiàn)出較明顯的正相關(guān)關(guān)系(R=0.76)。除幼果外,在其它不同組織中CitCHS2基因的表達(dá)水平與類黃酮的含量之間具有一致性。北京檸檬、塔羅科血橙和廣西憑祥土檸檬在6個不同的發(fā)育時期,其果皮中CitCHS2基因的表達(dá)與類黃酮含量之間表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.91,0.99和0.84。4、CHS基因家族成員的鑒定、表達(dá)分析及CitCHS3基因的鑒定從柑橘基因組數(shù)據(jù)庫中通過同源序列比對篩選到77條CHS的相似序列進(jìn)行聚類分析,除orange1.1t03054.1m外,其余76條CHS聚為三類(I,II,III),注釋分析表明第III類中的22條CHS基因為查爾酮合成酶基因,從中篩選了10條CHS作為候選基因,分別對甜橙幼苗進(jìn)行MeJA、低溫、高溫、和黑暗處理,研究了CHS候選基因的活性及在不同處理條件下的表達(dá)模式。在MeJA誘導(dǎo)下,檢測到了3個CHS基因的表達(dá),分別是Ciclev10005133m(CitCHS1)、Ciclev10015535m(CitCHS2)和Ciclev10001405m,其中Ciclev10001405m是首次發(fā)現(xiàn)其為柑橘CHS基因家族的成員,命名為CitCHS3。三個CHS中CitCHS1對MeJA的誘導(dǎo)響應(yīng)最明顯,CitCHS2和CitCHS3具有相似的表達(dá)模式,而且都在葉片、莖和子葉中表達(dá)。低溫處理下,CitCHS1、CitCHS2和CitCHS3在葉片、子葉和根中均能響應(yīng)低溫誘導(dǎo),但是在莖中,沒有檢測到CitCHS3的表達(dá)。CitCHS2能迅速響應(yīng)低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),且在所有組織中均有表達(dá)。高溫處理條件下,CitCHS1的表達(dá)水平在不同的組織之間差異顯著,最高的表達(dá)水平出現(xiàn)在根中,且高溫處理4h表達(dá)水平最高,之后逐漸降低且僅有CitCHS1繼續(xù)在根中表達(dá)。CitCHS2在葉片、莖和子葉中均有表達(dá)。CitCHS3在根中不表達(dá),在葉片和子葉中雖能檢測到表達(dá)但表達(dá)水平低。黑暗條件下,CitCHS1只在子葉中表達(dá),在其余3個組織部位中不表達(dá)。CitCHS2在所有組織中均能檢測到表達(dá),但在子葉中其表達(dá)水平極低,該基因在不同組織上具有相似的表達(dá)模式,即黑暗條件下,該基因的表達(dá)水平均降低。CitCHS3在葉片、子葉和莖中有表達(dá),在根中不表達(dá),該基因在不同組織部位中的表達(dá)模式相似,表現(xiàn)為先升高后降低。相關(guān)性分析顯示,3個CHS基因的總體表達(dá)水平與總類黃酮的含量之間存在正相關(guān)關(guān)系。對三個基因的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該三個基因的結(jié)構(gòu)非常保守,3個基因的DNA序列均由一個內(nèi)含子和兩個外顯子組成,而且第一個外顯子的核苷酸序列長度均為180bp,第二個外顯子不僅長度不同,且氨基酸位點(diǎn)的變異頻率更高。CitCHS1、CitCHS2和CitCHS3的ORF分別為1170 bp、1176 bp和1194 bp。5、CitCHS1、CitCHS2在轉(zhuǎn)基因植株中對類黃酮生物合成的調(diào)控作用通過植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在煙草上異源表達(dá)柑橘CitCHS1基因以確認(rèn)CitCHS1的功能。陽性植株上,CitCHS1基因在莖中的表達(dá)量最低,在葉片中的表達(dá)量最高,在根中的表達(dá)量居中�？傸S酮含量的檢測結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)基因煙草的葉片中,類黃酮含量最高,分別是空白對照和野生型對照的1.33倍和1.41倍。在莖和根中,過表達(dá)植株上類黃酮含量與對照組相比,略有升高,但無顯著差異。相關(guān)性分析顯示,在過表達(dá)CitCHS1基因的陽性植株上,CitCHS1的表達(dá)水平與類黃酮的含量存在正相關(guān)關(guān)系(R=0.73),在根和莖中也存在一定的相關(guān)性,但相關(guān)性不強(qiáng)(R0.5)。在過量表達(dá)CitCHS2基因的柑橘上,共獲得4株陽性植株,3株上調(diào)表達(dá),1株下調(diào)表達(dá)。在CitCHS2基因上調(diào)表達(dá)的植株中黃酮含量相應(yīng)增加,CitCHS2基因下調(diào)表達(dá)后,類黃酮含量相應(yīng)下降。相關(guān)性分析顯示,CitCHS2基因的表達(dá)與類黃酮含量呈顯著正相關(guān)。6、CitCHS3基因的功能驗證構(gòu)建了pGBi干擾載體遺傳轉(zhuǎn)化柑橘獲得轉(zhuǎn)基因植株,4株陽性植株上,CitCHS3基因平均干擾效果達(dá)76.01%(與野生型對照相比)和61.71%(與空載體對照相比)。對總黃酮的含量測定發(fā)現(xiàn):與對照相比,4株RNAi陽性植株上總黃酮含量下降明顯,表明CitCHS3基因?qū)︻慄S酮的含量有重要的影響。7、CitCHS家族成員對類黃酮生物合成的影響效應(yīng)利用CitCHS的保守序列通過VIGS轉(zhuǎn)基因沉默CitCHS的三個主要成員基因,4株陽性植株中,3個CitCHS基因的表達(dá)水平分別平均下調(diào)81.03%,79.67%和76.60%;與對照組相比,4株陽性植株上總黃酮含量平均下降41.11%。相關(guān)性分析顯示,總類黃酮含量與3個CHS基因的表達(dá)水平之間的相關(guān)性分別為0.90,0.43和0.80,CHS基因的表達(dá)量之和與總黃酮的含量呈顯著正相關(guān)。CHS基因家族不同成員存在表達(dá)差異,它們對類黃酮合成的貢獻(xiàn)力也因此不同。進(jìn)一步的分析結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)基因植株的葉片中,CitCHS1基因的表達(dá)量對CHS基因的總表達(dá)水平貢獻(xiàn)最少,占12.02%;CitCHS2基因的貢獻(xiàn)最大,占55.52%;CitCHS3基因的貢獻(xiàn)力介于CitCHS1和CitCHS2基因之間,占32.47%。在所有植株的葉片中,三個基因的表達(dá)對CHS基因的總表達(dá)水平的貢獻(xiàn)分別為13.29%、58.63%和28.09%�；虻谋磉_(dá)水平與類黃酮的含量之間的相關(guān)性分析結(jié)果表明,CitCHS1對黃烷酮類和二氫黃酮醇類含量的影響最大,CitCHS2對黃酮類和黃酮醇類的影響最大,CitCHS3對總黃酮含量的影響最大。同時,CitCHS2和CitCHS3基因之間存在顯著的共表達(dá)。 【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S666

【圖文】：

圖 1-1 苯丙氨酸代謝途徑[139]Fig.1-1 Phenylpropanoid pathway[139]植物類黃酮由羥基-肉桂酰輔酶 A 和丙二酰輔酶 A 作為底物分別衍生出 B 環(huán)和 A 環(huán)，且含有 C6-C3-C6 基本骨架[140]（圖 1-2）。查爾酮合成酶能夠催化 3 分子的丙二酰輔酶 A 和分子的香豆酰輔酶 A 縮合生成各種類黃酮化合物的基本骨架物質(zhì)-查爾酮[42, 141]。查爾酮糖化后的共軛物能夠使植物的花呈現(xiàn)黃色，但通常情況下，查爾酮產(chǎn)生后會立即被查爾酮異酶（Chalcone isomerase,CHI）催化，通過異構(gòu)反應(yīng)生成二氫黃烷酮（2s-flavanone），黃烷是類黃酮代謝過程最主要的產(chǎn)物[142]。

圖 1-1 苯丙氨酸代謝途徑[139]Fig.1-1 Phenylpropanoid pathway[139]羥基-肉桂酰輔酶 A 和丙二酰輔酶 A 作為底物分別衍生出 B本骨架[140]（圖 1-2）。查爾酮合成酶能夠催化 3 分子的丙酶 A 縮合生成各種類黃酮化合物的基本骨架物質(zhì)-查爾酮[4夠使植物的花呈現(xiàn)黃色，，但通常情況下，查爾酮產(chǎn)生后會merase,CHI）催化，通過異構(gòu)反應(yīng)生成二氫黃烷酮（2s-fla程最主要的產(chǎn)物[142]。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2712265