【摘要】：除蟲菊(Tanacetum cinerariifolium),為菊科多年生植物,其花頭不僅具有觀賞價(jià)值,更是天然殺蟲活性物質(zhì)——除蟲菊酯的植物源。前人研究多集中在除蟲菊酯的提取工藝與合成代謝。課題組前期對(duì)除蟲菊田間昆蟲調(diào)查發(fā)現(xiàn),瓢蟲在沒有食物源蚜蟲的情況下,大量出現(xiàn)在除蟲菊植株上。隨后,花頭揮發(fā)物測(cè)定發(fā)現(xiàn)花中含有高量的蚜蟲報(bào)警素(E)-beta-farnesene(EβF)。EβF是蚜蟲受到天敵攻擊時(shí)釋放的一種揮發(fā)性萜類物質(zhì),用來警示其他蚜蟲躲避危險(xiǎn)。同時(shí),蚜蟲的天敵如瓢蟲等能夠捕獲這個(gè)信號(hào)搜尋和定位潛在食物源。因此結(jié)合初步試驗(yàn)提出除蟲菊花頭可能通過釋放蚜蟲報(bào)警素來吸引天敵,并趨避蚜蟲的假設(shè)。為了進(jìn)一步闡明除蟲菊基于揮發(fā)物EβF吸引瓢蟲趨避蚜蟲的分子生態(tài)機(jī)制,我們分別在開放田間和人工控制的實(shí)驗(yàn)室,通過分析蚜蟲和瓢蟲的取食、報(bào)警和選擇行為與除蟲菊EβF合成釋放的關(guān)系,并克隆除蟲菊EβF合成酶基因與啟動(dòng)子對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證和表達(dá)特性分析。得到的主要研究結(jié)果如下:1.除蟲菊EbFS基因和啟動(dòng)子的克隆,表達(dá)分析和功能驗(yàn)證克隆到兩條除蟲菊EβF合成酶同源基因序列EbFS1和EbFS2,分別編碼575和577個(gè)氨基酸,屬于萜類合酶家族。原核表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),EbFS1和EbFS2都催化FPP只產(chǎn)生EβF。亞細(xì)胞定位表明,EbFS1和EbFS2在細(xì)胞內(nèi)的催化部位是細(xì)胞質(zhì),屬于典型的倍半萜合酶。除蟲菊EbFS基因在幼嫩的花器官(花苞期S1階段)表達(dá)量最高,且特異性地在花梗和花托部位高量表達(dá)。同時(shí)克隆了除蟲菊EbFS基因2.2 kb的啟動(dòng)子序列,構(gòu)建了融合GUS報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化菊花。組織染色分析表明,該啟動(dòng)子在靠近維管束的皮層細(xì)胞特異性表達(dá)。這些結(jié)果表明除蟲菊中控制EβF合成的是一個(gè)皮層特異表達(dá)的倍半萜合成酶基因。2.分析了除蟲菊EβF在自然條件和損傷處理后的釋放規(guī)律對(duì)不同發(fā)育階段除蟲菊植株進(jìn)行揮發(fā)物的頂空吸附和GC-MS測(cè)定,分析發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段揮發(fā)物釋放量較低,但是轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)之后,揮發(fā)物種類和含量(萜類為主)急劇增加。初花期除蟲菊揮發(fā)物中EβF釋放量最高,成為主要的萜類揮發(fā)物。隨著花朵的發(fā)育,另一個(gè)倍半萜大根香葉烯D快速增加,掩蓋了EβF成為豐度最高的揮發(fā)物。除蟲菊EβF釋放迅速地響應(yīng)機(jī)械損傷,并從未損傷狀態(tài)下的130 ng/h/株釋放量增加到5000 ng/h/株。除蟲菊EβF是從損傷部位大量釋放出來,在兩小時(shí)后恢復(fù)到正常水平。蚜蟲取食花器官并不能增加EβF的釋放。這些結(jié)果表明除蟲菊EβF的釋放受到發(fā)育階段調(diào)控,并響應(yīng)機(jī)械損傷。3.闡述了除蟲菊EβF儲(chǔ)存和釋放部位通過對(duì)除蟲菊不同器官內(nèi)含物提取和GC-MS分析,發(fā)現(xiàn)花頭和花梗均含有高量的EβF,花頭中最主要的兩個(gè)萜類物質(zhì)是EβF和大根香葉烯D,而花梗中幾乎僅有EβF。對(duì)花頭和花梗新鮮切片進(jìn)行萜類特異的聯(lián)苯胺反應(yīng)(NADI)染色發(fā)現(xiàn),紫色的萜類油狀物質(zhì)(主要是EβF)大量分布在維管束附近的皮層細(xì)胞。這些結(jié)果表明除蟲菊EβF在花梗和花托大量合成,并暫時(shí)儲(chǔ)存在皮層細(xì)胞。4.分析了蚜蟲蜜露揮發(fā)物及其對(duì)蚜蟲個(gè)體的行為影響通過收集取食除蟲菊花梗的蚜蟲蜜露,GC-MS分析發(fā)現(xiàn)蜜露中含有揮發(fā)性萜類物質(zhì)EβF,而對(duì)照植物本氏煙草飼養(yǎng)的蚜蟲蜜露未檢測(cè)到EβF,這表明蚜蟲在取食除蟲菊過程中攝入了植物的EβF,并從蜜露中分泌出來。為了模擬含有EβF的蜜露對(duì)蚜蟲行為的影響,利用含10 ng/μl EβF的人工蜜露,進(jìn)行蚜蟲報(bào)警行為實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明蜜露中EβF對(duì)蚜蟲產(chǎn)生報(bào)警效果。5.揭示了除蟲菊-蚜蟲-瓢蟲三者生態(tài)關(guān)系強(qiáng)制接種蚜蟲到除蟲菊植株上繁殖三代之后能得到適應(yīng)性的蚜蟲群體。相對(duì)于適應(yīng)除蟲菊的蚜蟲,非適應(yīng)性的蚜蟲在除蟲菊花頭上活動(dòng)更頻繁,表現(xiàn)出明顯的不安。EPG電刺吸監(jiān)測(cè)系統(tǒng)分析蚜蟲在除蟲菊不同器官(花梗、葉片、葉柄)上取食行為,發(fā)現(xiàn)蚜蟲在每個(gè)植物器官取食時(shí)都存在完整的取食波,說明蚜蟲在除蟲菊上能夠進(jìn)行基本的生命活動(dòng)。進(jìn)一步利用適應(yīng)和未適應(yīng)除蟲菊或EβF的蚜蟲,開展除蟲菊S2花朵揮發(fā)物對(duì)蚜蟲報(bào)警行為實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明非適應(yīng)性的蚜蟲趨避除蟲菊主要是因?yàn)槌x菊花頭揮發(fā)物中的EβF。室內(nèi)控制條件下瓢蟲行為試驗(yàn)表明,與其他發(fā)育階段的除蟲菊相比,花苞期除蟲菊顯著地吸引瓢蟲,而且機(jī)械損傷促進(jìn)這種吸引效果。綜上所述,花蕾期除蟲菊通過自發(fā)地釋放高量較純的EβF顯著吸引瓢蟲,同時(shí)趨避蚜蟲。機(jī)械損傷顯著促進(jìn)除蟲菊EβF的釋放,從而增強(qiáng)瓢蟲的吸引效果。除蟲菊EβF在花頭和花梗中靠近維管束的皮層細(xì)胞特異合成并短暫儲(chǔ)存,隨后被轉(zhuǎn)移到除蟲菊花頭和花梗的分泌腔中儲(chǔ)存。蚜蟲能夠在取食初級(jí)階段刺探到皮層儲(chǔ)存的EβF并攝入體內(nèi),最終在蚜蟲蜜露中釋放出來,達(dá)到進(jìn)一步報(bào)警蚜蟲的效果。該研究首次揭示了除蟲菊花器官中高量合成并釋放蚜蟲報(bào)警素EβF來吸引瓢蟲,并趨避蚜蟲的雙重防御機(jī)制,有效地保護(hù)了除蟲菊最重要的生殖器官:花朵。該研究為以后利用植物源信息素進(jìn)行生物防治和生態(tài)保護(hù)提供新的思路和手段。
【圖文】：

beta-法尼烯介導(dǎo)的除蟲菊-蚜蟲-瓢蟲分子生態(tài)機(jī)制研究5圖1-1 植物（果實(shí)和營(yíng)養(yǎng)器官）模擬系統(tǒng)(Schaefer and Ruxton 2009)海紅豆（Adenanthera pavonina） (a) 和短柄蘋婆（Sterculia brevissima）(b) 彩色的種子，研究表明這兩個(gè)植物能夠通過模擬肉質(zhì)果來增加種子擴(kuò)散效率。植物上黑色的斑點(diǎn)是模擬捕食性昆蟲（c）。葉片色彩也是植物為了保護(hù)葉片不受害蟲啃食，模擬受傷葉片的著色(d和e)。Fig 1-1. Examples of possible mimicry in fruits and vegetative tissueColourful seeds, such as those of Adenanthera pavonina (a) and Sterculia brevissima (b), have beensuggested to enhance dispersal by mimicking fleshy fruits. Dark plant colours have been hypothesised tomimic predator infestation, such as in Xanthum trumarium (c). Leaf variegation has been hypothesised tohave a protective function by mimicking leaf damage by herbivores, as highlighted by the colouration of anintact leaf of Caladium steudneriifolium (d) compared with that of a damaged leaf that was attacked bymining moth caterpillars (e)(Schaefer and Ruxton 2009).

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文10圖1-2 蚜蟲識(shí)別報(bào)警信號(hào)的分子機(jī)制Fig 1-2. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids (Zhang et al2018)1.3.1 植物中 EβF 釋放調(diào)控規(guī)律植物在生長(zhǎng)過程中時(shí)刻遭受各種脅迫因素危害，如病菌、機(jī)械損傷、蟲害、極端溫度等，為了響應(yīng)或者應(yīng)對(duì)這樣的威脅，植物必須調(diào)整它們的生理狀態(tài)。通過釋放揮發(fā)物作為植物與植物，甚至植物與昆蟲之間信號(hào)交流和傳遞的方式，，是植物迄今進(jìn)化出的比較經(jīng)典的防御體系(Ueda et al 2014)。植物通過組合不同種類的揮發(fā)物來傳遞不同的信號(hào)。馬鈴薯野生種（Solanumberthaultii Hawkes）中，自然狀態(tài)下就能夠從B型腺體中組成型釋放EβF(Gibson and Pickett 1983)；而有些植物EβF屬于誘導(dǎo)型釋放，在自然狀態(tài)釋放量很低，卻在遭受蟲害一段時(shí)間之后大量從損傷部位誘導(dǎo)釋放出來，如樟子松（Pinus sylvestris）、棉花（Gossypium hirsutum L.）、馬鈴薯（Solanumtuberosum）、土狼煙草（Nicotiana attenuata）、玉米（Zea mays L.）等植物在害蟲取食葉片一段時(shí)間之后
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S682.19

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2710698