發(fā)布時(shí)間：2020-06-09 02:40

【摘要】：本研究旨在探尋農(nóng)桿菌介導(dǎo)草地早熟禾不同受體材料的轉(zhuǎn)基因方法,分別采用以農(nóng)桿菌侵染草地早熟禾胚性愈傷組織和農(nóng)桿菌浸種法兩種,通過兩個(gè)植物二元表達(dá)載體(pTCK303-PpGBF1、pTCK303-PpGAMT1)轉(zhuǎn)入兩個(gè)外源基因,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)這兩種遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行詳細(xì)比較,實(shí)驗(yàn)主要的研究成果如下:1、在農(nóng)桿菌浸種法轉(zhuǎn)化草地早熟禾成熟種子的實(shí)驗(yàn)中,使用重懸后OD 600為0.9的菌液,加入三種不同的侵染受體真空處理3min,100rpm低速搖床震蕩10min,轉(zhuǎn)移到墊在培養(yǎng)皿里的濕潤(rùn)濾紙上黑暗培養(yǎng)3d。在濾紙上用篩選液篩選30d,移栽綠苗入土,壯苗30d后提取總DNA進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示,侵染剪掉新芽的種子,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的PCR鑒定陽性率較高。PCR 陽性植株共39株,轉(zhuǎn)化周期為3個(gè)月。2、在以早熟禾胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體的轉(zhuǎn)化研究中,得出OD 600為0.3,侵染時(shí)間為15min,和OD 600為0.6,侵染時(shí)間為10min,的組合侵染效果最好,可觀察到侵染后愈傷組織有新生的組織長(zhǎng)出,且無農(nóng)桿菌過度生長(zhǎng)的情況,最終得到轉(zhuǎn)基因陽性植株2株,轉(zhuǎn)化周期為8個(gè)月。本研究構(gòu)建了草地早熟禾巴潤(rùn)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)胚性愈傷的轉(zhuǎn)化體系,探索了對(duì)農(nóng)桿菌浸種法在草地早熟禾的可能性。實(shí)驗(yàn)表明浸種法可以縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間,對(duì)本領(lǐng)域的研究具有一定的價(jià)值。
【圖文】：

９｜逡逑９Ｈ逡逑圖２．１早熟禾Ｂａｒｏｎ邋ＲＮＡ提取凝膠電泳檢測(cè)圖像逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ邋Ｂａｒｏｎ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｉｍａｇｅ逡逑從ＲＮＡ的電泳圖像可以看出，ＲＮＡ由三條帶組成，條帶分明且清晰，可逡逑以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。逡逑２．１．３．２草地早熟禾基因的克隆逡逑實(shí)驗(yàn)根據(jù)ＡＧＪＭ７７基因序列及草地早熟禾前期轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的引逡逑物，以反轉(zhuǎn)錄得到的ｃＤＮＡ為模板，擴(kuò)增ＰｐＧＭＭｎ基因片段，瓊脂糖凝膠電泳逡逑檢測(cè)顯示，引物對(duì)ＧＡＭＴ１－Ｆ１／Ｒ１克隆出的條帶單一，長(zhǎng)度和預(yù)測(cè)相符，為逡逑１１４０ｂｐ，如圖邋２．２。逡逑Ｍ邋ＰｐＧＡＭＴＩ逡逑卜逡逑圖２．２邋／＾ＧｄＭ７７基因克隆凝膠電泳圖像逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋ＰｐＧＡＭＴＩ邋ｇｅｎｅ邋ｃｌｏｎｉｎｇ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃ

電泳檢測(cè)長(zhǎng)度，如下圖。將使電泳條帶長(zhǎng)度正確的菌液送睿博興科公司測(cè)序，將逡逑測(cè)序結(jié)果比對(duì)后讓公司返回菌液和質(zhì)粒，質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌ＧＶ３１０１，，挑逡逑單菌落進(jìn)行菌落ＰＣＲ檢測(cè)，電泳鑒定，如圖２．３，選擇使電泳條帶大小正確的菌逡逑液加等體積５０％甘油保存，存放在－８ＣＴＣ冰柜保存。逡逑２０００ｂｐ＿邐？邐二，＊邋Ｊ逡逑ｌＯＯＯｂｐ邋、逡逑圖邋２．３邋ＧＶ３１０１－ｐＴＣＫ３０３－／＾（＾ＩＭ７７邋菌液邋ＰＣＲ邋鑒定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．３邋ＰＣＲ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＧＶ３邋ｌＯｌ－ｐＴＣＫＳＯＳ－Ｐ／＾Ｇ＾Ｍｒ／邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ逡逑２．２農(nóng)桿菌浸種法轉(zhuǎn)化草地早熟禾逡逑２．２．１實(shí)驗(yàn)材料及試劑逡逑２．２．１．１植物材料逡逑草地早熟禾巴潤(rùn)種子來源于北京正道生態(tài)科技有限公司。逡逑２．２．１．２質(zhì)粒和菌株逡逑含有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌ＧＶ３１０１菌株，來源于前期實(shí)驗(yàn)。逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S688.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 曹國(guó)兵;索南才讓;;青海草地早熟禾耐寒性研究[J];青海草業(yè);2019年01期

2 張浩瑋;白小明;陳輝;樊敬輝;李雄亮;連亞紅;孫敏;;草地早熟禾(Poa pratensis)N積累、分配和硝酸還原酶活性對(duì)氮、磷肥的響應(yīng)[J];中國(guó)沙漠;2019年05期

3 袁曉君;龔振德;涂明月;陳祖春;吳月琴;何亞麗;;上海地區(qū)夏季干旱、強(qiáng)光照對(duì)草地早熟禾的影響[J];草業(yè)科學(xué);2019年08期

4 冷暖;劉曉巍;張娜;許立新;;草地早熟禾干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組差異性分析[J];草業(yè)學(xué)報(bào);2017年12期

5 張蕾;魏禎禎;王璐瑤;岳杰;安子寧;李彥慧;;模擬酸雨脅迫對(duì)草地早熟禾種子萌發(fā)特性的影響[J];河北林業(yè)科技;2018年02期

6 陳陽;孫華山;金一鋒;金忠民;陳雅君;;氮素調(diào)控對(duì)草地早熟禾解剖結(jié)構(gòu)及組織碳氮含量的影響[J];草原與草坪;2018年04期

7 張浩瑋;白小明;樊敬輝;李雄亮;連亞紅;孫敏;;不同水分處理對(duì)草地早熟禾生物量及N、P積累與分配的影響[J];草原與草坪;2018年05期

8 牛奎舉;金小煜;李慧萍;徐海鵬;金寧;馬暉玲;;甘肅野生草地早熟禾萌發(fā)期抗旱性鑒定與評(píng)價(jià)[J];草地學(xué)報(bào);2016年05期

9 屈言江;師尚禮;;隴牧草地早熟禾新品系的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[J];草原與草坪;2017年01期

10 王保平;董曉燕;董寬虎;朱慧森;李存福;;山西野生草地早熟禾主要農(nóng)藝性狀的多樣性分析[J];中國(guó)草地學(xué)報(bào);2015年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 路遠(yuǎn);張勁東;常根柱;周學(xué)輝;楊紅善;;美國(guó)蘭德馬克草地早熟禾坪用性狀評(píng)價(jià)[A];中國(guó)草學(xué)會(huì)青年工作委員會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集(下冊(cè))[C];2010年

2 閔星星;馬玉壽;李世雄;王彥龍;;施肥對(duì)青海草地早熟禾草地生產(chǎn)力的影響[A];中國(guó)草學(xué)會(huì)2013學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2013年

3 孫佳林;李宏;肖爽;李娜;劉芬芬;陳雅君;;不同高度和頻率修剪對(duì)黑龍江草地早熟禾生長(zhǎng)的影響[A];中國(guó)草學(xué)會(huì)2013學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2013年

4 楊時(shí)海;馬玉壽;施建軍;董全民;王彥龍;王柳英;孫小弟;盛麗;;青海草地早熟禾(Poa pratensis L.cv.Qinghai)近10年的研究進(jìn)展[A];2009中國(guó)草原發(fā)展論壇論文集[C];2009年

5 韓蕾;孫振元;巨關(guān)升;錢永強(qiáng);彭鎮(zhèn)華;;空間環(huán)境誘導(dǎo)的草地早熟禾突變體葉片解剖結(jié)構(gòu)變異觀察[A];全國(guó)作物生物技術(shù)與誘變技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

6 韓蕾;孫振元;巨關(guān)升;錢永強(qiáng);彭鎮(zhèn)華;;太空環(huán)境誘導(dǎo)的草地早熟禾皺葉突變株系蛋白質(zhì)組學(xué)研究[A];全國(guó)作物生物技術(shù)與誘變技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

7 佘建明;張保龍;何曉蘭;倪萬潮;;草地早熟禾抗病轉(zhuǎn)基因植株的獲得[A];長(zhǎng)三角現(xiàn)代植物生物學(xué)與農(nóng)業(yè)專題論壇論文集[C];2005年

8 陳雅君;高麗娜;何陽波;;草地早熟禾種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD鑒定與分類研究[A];中國(guó)草學(xué)會(huì)青年工作委員會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

9 孫彥;楊青川;張英華;;不同草地早熟禾品種苗期抗旱性研究[A];西部大開發(fā) 科教先行與可持續(xù)發(fā)展——中國(guó)科協(xié)2000年學(xué)術(shù)年會(huì)文集[C];2000年

10 祝美俊;王顯國(guó);孫彥;韓建國(guó);王培;樊奮成;鮑青龍;;施鉀對(duì)草地早熟禾生物量、枯草量和草坪質(zhì)量的影響[A];草坪與地被科學(xué)進(jìn)展論文匯編[C];2006年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 大農(nóng);草地早熟禾[N];山西科技報(bào);2002年

2 記者 周昆;草地早熟禾球道中本特草有望防除[N];中國(guó)花卉報(bào);2009年

3 潘全山;草地早熟禾[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2001年

4 馬其東;草地早熟禾的類型（上）[N];中國(guó)花卉報(bào);2003年

5 馬其東;草地早熟禾的類型（中）[N];中國(guó)花卉報(bào);2003年

6 馬其東;草地早熟禾的類型（下）[N];中國(guó)花卉報(bào);2003年

7 錢振權(quán) 　　;草地早熟禾種子價(jià)漲四成　[N];中國(guó)花卉報(bào);2003年

8 程霞;大躍進(jìn)草地早熟禾[N];中國(guó)花卉報(bào);2004年

9 馮俊;自由三號(hào)草地早熟禾[N];中國(guó)花卉報(bào);2004年

10 鐵錚;北京草坪一年可綠300天[N];科技日?qǐng)?bào);2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 甘露;草地早熟禾矮化突變體的遺傳差異分析及DXS1基因功能研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2019年

2 牛奎舉;外源5-氨基乙酰丙酸對(duì)干旱脅迫下草地早熟禾光合作用的調(diào)控機(jī)制[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 段碧華;草地早熟禾高頻再生體系的建立及基因槍導(dǎo)入甜菜堿脫氫酶基因的研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2005年

4 韓蕾;太空環(huán)境對(duì)草地早熟禾的誘變效應(yīng)及其誘成突變體的生物學(xué)變化[D];中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院;2005年

5 信金娜;草地早熟禾（Poa pratensis L.）抗旱耐鹽基因遺傳轉(zhuǎn)化[D];北京林業(yè)大學(xué);2006年

6 柴琦;坪用草地早熟禾抗旱性評(píng)價(jià)及硅對(duì)減輕其水分脅迫效應(yīng)的研究[D];蘭州大學(xué);2007年

7 張曉波;草地早熟禾根際促生菌（PGPR）特性及根際微生物區(qū)系研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2008年

8 許立新;草地早熟禾適應(yīng)干旱以及干旱后復(fù)水恢復(fù)機(jī)理研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2011年

9 徐佩賢;高羊茅和草地早熟禾對(duì)鎘的耐受能力和解毒機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2014年

10 李飛飛;轉(zhuǎn)AtDREBlA基因草地早熟禾適應(yīng)干旱及旱后復(fù)水的生理生化響應(yīng)[D];北京林業(yè)大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 曹益凡;外源甜菜堿對(duì)草地早熟禾抗旱性的影響[D];北京林業(yè)大學(xué);2017年

2 陳

本文編號(hào)：2704048