【摘要】：柿(Diospyros kaki)一般分為澀柿和甜柿,我國為以澀柿為主,成熟澀柿果實采后需經(jīng)人工脫澀處理后才可食用。本文以6種澀柿品種('鏡面柿,、'益都托柿,、'沒皮柿'、'磨盤柿'、'臨潼掛桿柿,、'耀縣五花柿,)為實驗材料,通過高濃度CO2處理(AHCA)進行脫澀,利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析,篩選響應AHCA處理的關鍵轉錄因子,探索有效轉錄因子之間的相互作用機制,豐富和完善柿果實采后脫澀低氧處理的轉錄調控機制。主要結果如下:1.基于轉錄組測序,獲得了參與脫澀調控的新型轉錄因子。以在AHCA處理下快速脫澀的'鏡面柿'為材料,開展了 RNA-seq分析。以差異基因表達量(AHCA處理1d的FPKM絕對值)大于50和差異表達倍數(shù)(AHCA處理1 d/CK 1d)大于5為篩選標準,篩選獲得了 23個脫澀相關轉錄因子。通過雙熒光素酶體系分析,篩選得到的轉錄因子DkERF29、DkZAT2、DkASR1能夠轉錄激活脫澀關鍵靶標基因DkPDC2的啟動子。且DkERF29是目前發(fā)現(xiàn)的對DkPDC2啟動子具有最強調控效應的轉錄因子,達到6.51倍。并進一步通過EMSA體系明確了 DkERF29的結合位點為DkPDC2啟動子序列上的GCC-box序列。柿果實圓片瞬時表達發(fā)現(xiàn),相比對照,DkERF29、DkZAT2、DkASR1的瞬時過量表達均可顯著降低柿果實圓片中可溶性單寧含量。2.脫澀調控轉錄因子間協(xié)同效應分析。本文篩選得到的DkERF29、DkZAT2、DkASR1和前期報道轉錄因子DkERF9、DkERF19,均可有效調控DkPDC2啟動子,因此本研究進一步分析了以上轉錄因子間的協(xié)同效應。雙熒光素酶結果分析顯示DkERF29能分別與DkERF19和DkZAT2對DkPDC2啟動子產(chǎn)生協(xié)同增強效應。通過BiiFC體系驗證DkERF29與DkERF19和DkZAT2均存在蛋白-蛋白互作關系。3.脫澀相關轉錄因子在5個澀柿品種中的表達分析。選取5個對AHCA采后脫澀處理存在響應差異的品種,發(fā)現(xiàn)DkZAT2的基因表達在這5個品種間呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。在響應AHCA處理(即在AHCA處理下果實快速脫澀)的品種中,DkZAT2的基因表達明顯受處理上調;在不響應AHCA處理(即在AHCA處理下無法快速脫澀)的品種中,DkZAT2的基因表達上調有限。進一步驗證以上5個轉錄因子對氧氣的響應能力,在常氧條件下檢測0-8天的基因表達情況,發(fā)現(xiàn)DkErf29的表達平均要高于其他轉錄因子,而dKzat2基因基本無表達。因此推測,DkZAT2是脫澀過程中的低氧信號響應主要轉錄因子。綜上所述,本文推測在柿果實采后脫澀過程中,存在“信號響應”和“調控處理”兩類轉錄因子。在低氧處理條件下,實現(xiàn)“信號響應”的DkZAT2等轉錄因子能快速響應低氧條件,并向下游傳遞低氧信號,通過與DkERF29結合,放大轉錄調控信號,促進DkPDC2基因表達,生成低氧代謝產(chǎn)物乙醛,完成采后脫澀。
【圖文】：

邐３結果與分析逡逑于對照１山差異上調基因３４６１個，差異下調基因３５３１個（圖３．２ａ）。對兩組逡逑差異分析結果進一步分析，發(fā)現(xiàn)有共同差異上調基因２３６９，共同差異下調基因逡逑２６６０個（圖３．２ｃ）。通過ｆＴＡＫ分析

１７３個共同差異上調轉錄因子展開進一步的篩選。以差異基因表達量（轉錄因子逡逑在ＡＨＣＡ處理Ｉｄ的ＦＰＫＭ絕對值）和差異表達倍數(shù)（轉錄因子在ＡＨＣＡ處理逡逑１邋ｄ相較于ＣＫ邋Ｉｄ的上調倍數(shù)）為兩個維度（圖３．３），將共同差異上調轉錄因逡逑子中基因表達量大于２０，差異表達倍數(shù)大于２倍的９４個轉錄因子細分為４２組。逡逑本實驗以ＦＰＫＭ大于５０，差異表達倍數(shù)大于５作為最終篩選標準（圖３．３）。篩逡逑選得到４３個轉錄因子，其中１０個轉錄因子已發(fā)表，本實驗新克隆得到２３個轉逡逑錄詛子，，包括邋ＤｋＥＲＦ２９／３０／３１、ＤｋＧＬＫｌ／２、Ｄｋｔｒｉｈｅｌｉｘｌ、ＤｋＧＲＡＳｌ／２／３、ＤｋＺＡＴｌ／２、逡逑ＤｋＡＳＲｌ、ＤｋｂＨＬＨ３／４、ＤｋＷＲＫＹ８／９／Ｉ０、ＤｋＮＡＣ１０／ｌＩ、ＤｋＨＳＦ２、ＤｋＭＢＦｌ、ＤｋｂＺＩＰ６逡逑和并構建于ＳＫ載體中。通過雙熒光素酶體系發(fā)現(xiàn)拉？逡逑和能夠顯著誘導啟動子活性，誘導倍數(shù)分別徶到６．５１倍、２．０２逡逑倍和２．０２倍，對啟動子的誘導倍數(shù)為２．０２倍（圖３．４）。逡逑３．４邋ＺＷｔ五及尸２９、、ＺＷｔＡＳｉＷ在柿果實圓片中瞬時過董表徸分逡逑析逡逑進步一對驗證得到具有調控效應的轉錄因子逡逑進行圓片瞬時過量表達分析。選取對照載體ＳＫ邋（即未進行基因構建的ＳＫ空載逡逑體）作為對照，三個轉錄因子Ｚ）々Ｚ４ｒ２、￡＞以R%７）侵染后的柿果實逡逑圓片中
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S665.2

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本文編號：2700171