【摘要】：柿(Diospyros kaki)一般分為澀柿和甜柿,我國(guó)為以澀柿為主,成熟澀柿果實(shí)采后需經(jīng)人工脫澀處理后才可食用。本文以6種澀柿品種('鏡面柿,、'益都托柿,、'沒皮柿'、'磨盤柿'、'臨潼掛桿柿,、'耀縣五花柿,)為實(shí)驗(yàn)材料,通過高濃度CO2處理(AHCA)進(jìn)行脫澀,利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析,篩選響應(yīng)AHCA處理的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,探索有效轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用機(jī)制,豐富和完善柿果實(shí)采后脫澀低氧處理的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。主要結(jié)果如下:1.基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得了參與脫澀調(diào)控的新型轉(zhuǎn)錄因子。以在AHCA處理下快速脫澀的'鏡面柿'為材料,開展了 RNA-seq分析。以差異基因表達(dá)量(AHCA處理1d的FPKM絕對(duì)值)大于50和差異表達(dá)倍數(shù)(AHCA處理1 d/CK 1d)大于5為篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選獲得了 23個(gè)脫澀相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。通過雙熒光素酶體系分析,篩選得到的轉(zhuǎn)錄因子DkERF29、DkZAT2、DkASR1能夠轉(zhuǎn)錄激活脫澀關(guān)鍵靶標(biāo)基因DkPDC2的啟動(dòng)子。且DkERF29是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)DkPDC2啟動(dòng)子具有最強(qiáng)調(diào)控效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,達(dá)到6.51倍。并進(jìn)一步通過EMSA體系明確了 DkERF29的結(jié)合位點(diǎn)為DkPDC2啟動(dòng)子序列上的GCC-box序列。柿果實(shí)圓片瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照,DkERF29、DkZAT2、DkASR1的瞬時(shí)過量表達(dá)均可顯著降低柿果實(shí)圓片中可溶性單寧含量。2.脫澀調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子間協(xié)同效應(yīng)分析。本文篩選得到的DkERF29、DkZAT2、DkASR1和前期報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子DkERF9、DkERF19,均可有效調(diào)控DkPDC2啟動(dòng)子,因此本研究進(jìn)一步分析了以上轉(zhuǎn)錄因子間的協(xié)同效應(yīng)。雙熒光素酶結(jié)果分析顯示DkERF29能分別與DkERF19和DkZAT2對(duì)DkPDC2啟動(dòng)子產(chǎn)生協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。通過BiiFC體系驗(yàn)證DkERF29與DkERF19和DkZAT2均存在蛋白-蛋白互作關(guān)系。3.脫澀相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在5個(gè)澀柿品種中的表達(dá)分析。選取5個(gè)對(duì)AHCA采后脫澀處理存在響應(yīng)差異的品種,發(fā)現(xiàn)DkZAT2的基因表達(dá)在這5個(gè)品種間呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。在響應(yīng)AHCA處理(即在AHCA處理下果實(shí)快速脫澀)的品種中,DkZAT2的基因表達(dá)明顯受處理上調(diào);在不響應(yīng)AHCA處理(即在AHCA處理下無法快速脫澀)的品種中,DkZAT2的基因表達(dá)上調(diào)有限。進(jìn)一步驗(yàn)證以上5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)氧氣的響應(yīng)能力,在常氧條件下檢測(cè)0-8天的基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)DkErf29的表達(dá)平均要高于其他轉(zhuǎn)錄因子,而dKzat2基因基本無表達(dá)。因此推測(cè),DkZAT2是脫澀過程中的低氧信號(hào)響應(yīng)主要轉(zhuǎn)錄因子。綜上所述,本文推測(cè)在柿果實(shí)采后脫澀過程中,存在“信號(hào)響應(yīng)”和“調(diào)控處理”兩類轉(zhuǎn)錄因子。在低氧處理?xiàng)l件下,實(shí)現(xiàn)“信號(hào)響應(yīng)”的DkZAT2等轉(zhuǎn)錄因子能快速響應(yīng)低氧條件,并向下游傳遞低氧信號(hào),通過與DkERF29結(jié)合,放大轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào),促進(jìn)DkPDC2基因表達(dá),生成低氧代謝產(chǎn)物乙醛,完成采后脫澀。
【圖文】：

邐３結(jié)果與分析逡逑于對(duì)照１山差異上調(diào)基因３４６１個(gè)，差異下調(diào)基因３５３１個(gè)（圖３．２ａ）。對(duì)兩組逡逑差異分析結(jié)果進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)有共同差異上調(diào)基因２３６９，共同差異下調(diào)基因逡逑２６６０個(gè)（圖３．２ｃ）。通過ｆＴＡＫ分析

１７３個(gè)共同差異上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子展開進(jìn)一步的篩選。以差異基因表達(dá)量（轉(zhuǎn)錄因子逡逑在ＡＨＣＡ處理Ｉｄ的ＦＰＫＭ絕對(duì)值）和差異表達(dá)倍數(shù)（轉(zhuǎn)錄因子在ＡＨＣＡ處理逡逑１邋ｄ相較于ＣＫ邋Ｉｄ的上調(diào)倍數(shù)）為兩個(gè)維度（圖３．３），將共同差異上調(diào)轉(zhuǎn)錄因逡逑子中基因表達(dá)量大于２０，差異表達(dá)倍數(shù)大于２倍的９４個(gè)轉(zhuǎn)錄因子細(xì)分為４２組。逡逑本實(shí)驗(yàn)以ＦＰＫＭ大于５０，差異表達(dá)倍數(shù)大于５作為最終篩選標(biāo)準(zhǔn)（圖３．３）。篩逡逑選得到４３個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中１０個(gè)轉(zhuǎn)錄因子已發(fā)表，本實(shí)驗(yàn)新克隆得到２３個(gè)轉(zhuǎn)逡逑錄詛子，，包括邋ＤｋＥＲＦ２９／３０／３１、ＤｋＧＬＫｌ／２、Ｄｋｔｒｉｈｅｌｉｘｌ、ＤｋＧＲＡＳｌ／２／３、ＤｋＺＡＴｌ／２、逡逑ＤｋＡＳＲｌ、ＤｋｂＨＬＨ３／４、ＤｋＷＲＫＹ８／９／Ｉ０、ＤｋＮＡＣ１０／ｌＩ、ＤｋＨＳＦ２、ＤｋＭＢＦｌ、ＤｋｂＺＩＰ６逡逑和并構(gòu)建于ＳＫ載體中。通過雙熒光素酶體系發(fā)現(xiàn)拉？逡逑和能夠顯著誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性，誘導(dǎo)倍數(shù)分別徶到６．５１倍、２．０２逡逑倍和２．０２倍，對(duì)啟動(dòng)子的誘導(dǎo)倍數(shù)為２．０２倍（圖３．４）。逡逑３．４邋ＺＷｔ五及尸２９、、ＺＷｔＡＳｉＷ在柿果實(shí)圓片中瞬時(shí)過董表徸分逡逑析逡逑進(jìn)步一對(duì)驗(yàn)證得到具有調(diào)控效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子逡逑進(jìn)行圓片瞬時(shí)過量表達(dá)分析。選取對(duì)照載體ＳＫ邋（即未進(jìn)行基因構(gòu)建的ＳＫ空載逡逑體）作為對(duì)照，三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Ｚ）々Ｚ４ｒ２、￡＞以R%７）侵染后的柿果實(shí)逡逑圓片中
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S665.2

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本文編號(hào)：2700171