【摘要】：番茄(Solanum lycopersicum L.)是世界性的蔬菜,而且是重要的模式植物之一。在番茄的生長過程中,生物和非生物脅迫等嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子亞家族是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中數(shù)目最多的一類,廣泛參與了植物的生長發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物合成和脅迫應(yīng)答。目前,在番茄中僅有少數(shù)的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子被克隆和鑒定功能,而番茄基因組測序的完成,為利用反向遺傳學(xué)進行基因功能的研究提供了有利條件。本研究在番茄基因組中鑒定得到121個R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子,并對其進行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析,篩選出可能響應(yīng)非生物脅迫的51個基因,通過分析這些基因在非生物脅迫條件下的表達(dá)變化,進一步篩選出2個相關(guān)基因進行功能驗證。主要研究結(jié)果如下:1、利用擬南芥126個R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子進行BlastP同源比對,在番茄基因組中鑒定出121個R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子,并對其進行N端R2和R3保守域的保守性分析、基因結(jié)構(gòu)的特征分析、與其他物種的進化關(guān)系分析以及基因在染色體上的定位分析。2、利用進化關(guān)系結(jié)合已知的同源基因功能注釋,在番茄121個R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子中篩選出51個可能響應(yīng)非生物脅迫的基因,在非生物脅迫處理下檢測這些基因的表達(dá)量變化,其中有10個基因響應(yīng)NaCl處理,11個基因響應(yīng)ABA處理,14個基因響應(yīng)低溫4℃處理,說明番茄R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子可能在植物的非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。對51個R2R3MYB基因進行組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)存在組織表達(dá)特異性和表達(dá)模式多樣性,據(jù)此推測番茄R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控不同組織的生長發(fā)育和代謝進程。3、對克隆得到的非生物脅迫響應(yīng)基因SlMYB41構(gòu)建過表達(dá)載體,利用番茄遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因株系,表型分析結(jié)果表明過表達(dá)SlMYB41影響植株的正常生長,具體表現(xiàn)為植株變矮、葉面積減小、種子變小。4、為進一步探究SlMYB41基因的功能,分別取幼苗時期的35S:SlMYB41轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株進行轉(zhuǎn)錄組測序。差異表達(dá)基因分析結(jié)果顯示,在SlMYB41過表達(dá)株系中,許多與脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)量顯著上調(diào),說明過表達(dá)SlMYB41可能影響番茄的抗性�？购翟囼灲Y(jié)果顯示,SlMYB41過表達(dá)株系耐旱性顯著高于野生型株系。5、以SlMYB41基因的啟動子為誘餌進行酵母單雜交篩庫,篩選得到一個番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子,與擬南芥ERF105同源;酵母單雜交驗證結(jié)果顯示SlERF105能夠結(jié)合SlMYB41基因的啟動子。構(gòu)建酵母質(zhì)粒pGBKT7-SlMYB41轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中,結(jié)果顯示SlMYB41具有明顯的自激活活性,進一步研究發(fā)現(xiàn)SlMYB41的自激活活性區(qū)域在269-334aa之間。6、為驗證SlMYB64的基因功能,對SlMYB64及其已知功能的同源基因進行進化關(guān)系分析,并將基因功能進行分類,對比發(fā)現(xiàn)SlMYB64在花粉發(fā)育方面的功能是該亞群的一個新功能。7、對SlMYB64過表達(dá)株系在幼苗期和開花期進行表型分析,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系植株高度降低、主根變短、葉面積減小,說明SlMYB64可能負(fù)調(diào)控番茄的生長發(fā)育。8、為進一步驗證SlMYB64在花粉發(fā)育方面的功能,本研究用半薄切片方法觀察SlMYB64過表達(dá)株系和對照株系花藥不同發(fā)育時期的形態(tài)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)35S:SlMYB64株系絨氈層發(fā)育和退化以及花粉小孢子的發(fā)育出現(xiàn)異常。熒光定量PCR檢測顯示隨著花藥的發(fā)育SlMYB64基因表達(dá)量逐漸降低,而在過表達(dá)株系中SlMYB64表達(dá)量在花藥發(fā)育的每個時期都過量表達(dá)6倍以上�；ǚ垠w內(nèi)萌發(fā)試驗證明SlMYB64只影響番茄的雄性育性。9、分別取SlMYB64過表達(dá)株系和非轉(zhuǎn)基因株系第13時期的花藥進行轉(zhuǎn)錄組分析,GO富集分析顯示與花粉壁發(fā)育相關(guān)基因顯著富集,說明SlMYB64直接或者間接參與花粉壁的形成。與番茄ms10~(35)(sldyt1)雄性不育突變體轉(zhuǎn)錄組差異基因進行比較,發(fā)現(xiàn)有26個共同差異表達(dá)基因,說明它們共同參與番茄花藥發(fā)育。酵母雙雜交驗證結(jié)果顯示SlMYB64與SlDYT1蛋白不能直接發(fā)生互作,說明SlMYB64與SlDYT1通過不同的調(diào)控路徑共同參與調(diào)控番茄的雄性育性。
【圖文】：

番茄 R2R3MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定及 SlMYB41 和 SlMYB64 基因功能研究數(shù)分裂形成單核小孢子；第二個階段是雄配子體的發(fā)生，減數(shù)分裂形成的育成成熟的花粉（圖 1-2）。這些過程除了受到基因的調(diào)控之外同時也受到響（McCormick, 2004）。發(fā)育中的花藥包含中間的減數(shù)分裂細(xì)胞（也稱為）和四周圍繞的花藥壁�；ㄋ幈诜譃樗膶�，從外到內(nèi)依次是表皮層、內(nèi)層氈層（圖 1-3）（Li et al., 2011）。絨氈層在小孢子細(xì)胞的發(fā)育中起到非常重僅分泌胼胝質(zhì)酶，分解包裹四分體的胼胝質(zhì)，釋放出小孢子，而且也能為提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，包括糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、花粉外壁合成前體物質(zhì)四分體細(xì)胞分解釋放后到雄配子體有絲分裂之前，絨氈層進行細(xì)胞程序性，而絨氈層細(xì)胞 PCD 的提前或者滯后，以及絨氈層的形態(tài)和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常孢子的發(fā)育成熟，以致影響花粉的育性（Ku et al., 2003; Varnier et al., 2005;）。

圖 1-3 植物花藥的結(jié)構(gòu)（Bedinger. 1992）Fig. 1-3 The structure of anther in plant個 MADS-box 類型的轉(zhuǎn)錄因子，，能夠直接結(jié)合 SPL/NZZ 基因的啟動子，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在花藥的早期發(fā)育過程中起重要的作用（Ito et al., 2004）。在花早期，也有一些蛋白激酶能夠決定花藥細(xì)胞的命運。如擬南芥 EXS/EMS1 基因富含亮氨酸重復(fù)序列的受體蛋白激酶，其突變體產(chǎn)生過多的小孢子母細(xì)胞、缺細(xì)胞，表現(xiàn)為完全的雄性不育（Canales et al., 2002; Zhao et al., 2002）。除此之南芥中另外兩個富含亮氨酸重復(fù)序列的受體蛋白激酶基因BAM1和BAM2能與形成調(diào)控環(huán)，抑制 SPL/NZZ 在花藥中的表達(dá)，同時也受 SPL/NZZ 的調(diào)控，參早期發(fā)育（Hord et al., 2006; Feng et al., 2010）。近期研究表明，許多編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因參與絨氈層的發(fā)育和 PCD。在擬DYSFUNCTIONAL TAPETUM1（DYT1）（Zhang et al., 2006; Feng et al., 2012）和 AMICROSPORES（AMS）（Sorensen et al., 2003; Xu et al., 2010, 2014; Ferguson et
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S641.2

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