發(fā)布時(shí)間：2020-05-31 20:17

【摘要】：羊肚菌在生物分類(lèi)上屬于子囊菌門(mén),為世界著名的食藥兼用用菌,風(fēng)味獨(dú)特,并具有抗氧化、消炎、抗菌、免疫刺激和抗腫瘤等多種生物活性。2012年以來(lái),羊肚菌大田栽培首次在我國(guó)四川成功實(shí)施,并快速向全國(guó)輻射。然而,與羊肚菌人工栽培快速發(fā)展形勢(shì)不相稱(chēng)的是,羊肚菌的基礎(chǔ)理論研究還比較落后,限制了羊肚菌產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康和穩(wěn)定發(fā)展。譬如,羊肚菌菌核發(fā)育機(jī)制、菌種質(zhì)量評(píng)價(jià)、育種新技術(shù)應(yīng)用等研究,將促進(jìn)羊肚菌生產(chǎn)的健康發(fā)展。本研究采用電子顯微術(shù)和激光共聚焦顯微術(shù)研究了羊肚菌菌核發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)和生理變化,發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌核發(fā)育涉及了自噬、凋亡和壞死等事件,羊肚菌菌核的能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)為脂肪;建立了羊肚菌栽培菌株身份(identity)、交配型(mating type)和活力(vitality)的IMV檢測(cè)技術(shù),可用于羊肚菌人工栽培菌株在大生產(chǎn)中的適應(yīng)性檢驗(yàn);優(yōu)化了羊肚菌原生質(zhì)體釋放和再生技術(shù),建立了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌種間雙滅活融合技術(shù),獲得了一批融合菌株,對(duì)推動(dòng)羊肚菌原生質(zhì)體融合育種技術(shù)發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。主要研究結(jié)果如下:(1)對(duì)梯棱羊肚菌1號(hào)菌株,菌絲重復(fù)分枝和末端菌絲或亞末端菌絲分枝的擴(kuò)大形成菌核原基,其菌核發(fā)育兼具末端型和側(cè)生型特性,為復(fù)合型;透射電子顯微術(shù)研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌核發(fā)育涉及了自噬、凋亡和壞死事件;活細(xì)胞共聚焦激光成像研究揭示了菌核中的能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)為脂質(zhì)性質(zhì)。脂肪的定性測(cè)定表明,菌核中積累的脂肪多于營(yíng)養(yǎng)菌絲細(xì)胞。(2)分別采用ITS-1/ITS-4、RPB1B-F/RPB1B-R、RPB2B-F/RPB2B-R引物對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的6種羊肚菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)定了其ITS、RPB1B、RPB2B基因序列,并進(jìn)行了序列比對(duì)分析。結(jié)果表明,菌株4號(hào)和XuChang為梯棱羊肚菌(Morchella importuna),菌株201、13號(hào)、SZL-3號(hào)為六妹羊肚菌(Morchella sextelata),菌株CuBing與Morchella kaibabensis同源相似性為98.9%,可信度為100%。設(shè)計(jì)和篩選了羊肚菌交配型基因測(cè)定的特異性引物,發(fā)現(xiàn)引物對(duì)Mat1-1/Mat1-1-1可特異性鑒定六妹羊肚菌的交配型,引物對(duì)Mat1-1-1/Mat1-2-1能夠鑒定梯棱羊肚菌的交配型。采用篩選的引物對(duì)分別對(duì)測(cè)定的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)每對(duì)引物均能擴(kuò)增出1條清晰的條帶,并且混合引物均能擴(kuò)增出兩個(gè)條帶。這些結(jié)果表明,篩選的引物對(duì)可用于六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的交配型分析,測(cè)試的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株均未發(fā)生交配型缺失,六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌均屬于典型的異宗結(jié)合真菌。測(cè)定了六個(gè)羊肚菌菌株的脂質(zhì)過(guò)氧化水平,評(píng)價(jià)菌株的衰老情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌株SZL-3和CuBing老化程度最高,菌株201、13號(hào)活力最強(qiáng),菌株4號(hào)、XuChang老化程度介于二者之間。(3)對(duì)梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌原生質(zhì)體釋放條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,梯棱羊肚菌原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件為:穩(wěn)滲劑為0.6 M甘露醇,酶液體系為2%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶,菌齡為3 d。在該優(yōu)化條件下,梯棱羊肚菌原生質(zhì)體產(chǎn)量為1×10~6個(gè)/mL,原生質(zhì)體再生率可達(dá)1.8%。六妹羊肚菌原生質(zhì)體制備最佳條件為:穩(wěn)滲劑為0.6 M甘露醇,酶液體系為2%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶,菌齡為3 d。在該優(yōu)化條件下,六妹羊肚菌原生質(zhì)體產(chǎn)量為6.5×10~5個(gè)/mL,原生質(zhì)體再生率可達(dá)1.5%。(4)優(yōu)化了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌種間雙滅活原生質(zhì)體融合條件。結(jié)果表明,2種羊肚菌種間原生質(zhì)體融合的最優(yōu)條件為:原生質(zhì)體融合溫度25℃,溶液pH 8.0,CaCl_2終濃度50 mmol/L,融合劑PEG濃度25%。在優(yōu)化條件下,原生質(zhì)體融合率可達(dá)0.8%。(5)篩選了鑒定2種羊肚菌的特異性RAPD(random amplified polymorphism DNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)分子標(biāo)記。測(cè)定了2親本及融合子的RAPD標(biāo)記,通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)雙親本與融合子可分為3大類(lèi)群:第一類(lèi)群包括親本梯棱羊肚菌(P1),第二類(lèi)群包括所有融合子,第三類(lèi)群包括親本六妹羊肚菌(P2)。16個(gè)融合子可以分為3組,其中1、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16為一組,4、7為一組,2、3為一組。這些結(jié)果表明,采用梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌種間雙滅活融合技術(shù)獲得的羊肚菌原生質(zhì)體融合子為真正的融合子。(6)分別選取融合子1號(hào)(R1)、融合子2號(hào)(R2)、融合子4號(hào)(R4)、和雙親本進(jìn)行培養(yǎng),比較每種融合子和雙親本菌株的菌落形態(tài)差異,發(fā)現(xiàn)梯棱羊肚菌(P1)、六妹羊肚菌(P2)、R1、R2、R4均產(chǎn)菌核且產(chǎn)量多,菌核形態(tài)均為點(diǎn)狀;按照菌絲生長(zhǎng)速度,各菌株的排列順序?yàn)?R4P1P2R2R1,但5菌株生長(zhǎng)速度相差不大;不同菌株的菌塊恢復(fù)時(shí)間不同,其中P2恢復(fù)時(shí)間最長(zhǎng),P1恢復(fù)時(shí)間最短,1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)融合子介于二者之間;P1、R1、R2、R4的菌絲緊密、P2稀疏;所有菌株菌落邊緣均整齊。這些結(jié)果表明,2種羊肚菌的融合子為真正的融合菌株。(7)人工栽培發(fā)現(xiàn),融合子R1和R4子囊果形態(tài)上接近2號(hào)親本(P2,為六妹羊肚菌),R5和R8形態(tài)接近于1號(hào)親本(P1,為梯棱羊肚菌),而R2和R3介于兩親本之間。(8)人工栽培表明,2親本與6個(gè)融合子8個(gè)菌株產(chǎn)量之間均差異顯著,沒(méi)有任何融合子菌株產(chǎn)量超過(guò)P1親本菌株,而R2融合子產(chǎn)量低于P2親本,暗示在原生質(zhì)體融合育種中,親本的選擇很重要(P2親本已經(jīng)退化和老化);也同時(shí)說(shuō)明,通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得高產(chǎn)菌株的局限性很大;但該技術(shù)在綜合親本其他優(yōu)良性狀的融合菌株選育方面具有較大潛力。
【圖文】：

鄭州輕工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文E3123 和 GME3124，GME3123 含有 4 個(gè)內(nèi)含子，編碼 488 個(gè)氨基酸，1688bE 3124 含有 5 個(gè)內(nèi)含子，編碼 512 個(gè)氨基酸，1825bp。BLASTx 分析表明E3123 與 GME3124 分別與 Tuber borchii 的假定蛋白(AIU38081.1)的氨基酸為 24%，21%[40]。這些 ORFs 與先前發(fā)表的交配型基因的同源物有很大不此，我們推測(cè)它們是僅在羊肚菌中發(fā)現(xiàn)的新的交配基因。對(duì)梯棱羊肚importuna、六妹羊肚菌 M.sextelata 的單子囊孢子種群進(jìn)行了分析，結(jié)果表 MAT1-1-1 和 MAT1-2-1 的等位位點(diǎn)的比例與 1:1 的比例沒(méi)有顯著差異。明，這兩種黑羊肚菌是異源的。

遷移率基團(tuán)(HMG)蛋白(MAT1-2-1)[42]。相反，同宗交配型真菌可自我在沒(méi)有交配伴侶的情況下完成生殖周期。典型地，一個(gè)單一的純合體菌個(gè)單倍體核中含有兩個(gè) MAT 基因（連鎖的或非連鎖的）[35, 42]。在過(guò)去，分子技術(shù)，特別是基因組測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，為深入理解羊肚菌物種的和生殖方式鋪平了道路。羊肚菌為異宗結(jié)合食用菌，也就是說(shuō)，必須有 2 種不同交配型發(fā)生親和具有 2 種交配型基因（Mat1-1-1 和 Mat 1-2-1）的菌株，才能用于人工單一交配型 Mat1-1-1 或 Mat 1-2-1）的菌株用于生產(chǎn)，存在較大的不出更加重要的是，羊肚菌交配型基因在羊肚菌子囊果中的分配不均一（圖，也就是說(shuō)，靠單孢分離和組織分離獲得的菌種，存在著單一交配型基風(fēng)險(xiǎn)，這樣的無(wú)效菌種用于生產(chǎn)，將使菇農(nóng)戶(hù)面臨著巨大的失敗風(fēng)險(xiǎn)。產(chǎn)菌種進(jìn)行交配型檢測(cè)，只將同時(shí)具有 2 種交配型的菌種用于生產(chǎn)，對(duì)具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：鄭州輕工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S646.7

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本文編號(hào)：2690405