【摘要】：羊肚菌在生物分類上屬于子囊菌門,為世界著名的食藥兼用用菌,風(fēng)味獨特,并具有抗氧化、消炎、抗菌、免疫刺激和抗腫瘤等多種生物活性。2012年以來,羊肚菌大田栽培首次在我國四川成功實施,并快速向全國輻射。然而,與羊肚菌人工栽培快速發(fā)展形勢不相稱的是,羊肚菌的基礎(chǔ)理論研究還比較落后,限制了羊肚菌產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康和穩(wěn)定發(fā)展。譬如,羊肚菌菌核發(fā)育機制、菌種質(zhì)量評價、育種新技術(shù)應(yīng)用等研究,將促進(jìn)羊肚菌生產(chǎn)的健康發(fā)展。本研究采用電子顯微術(shù)和激光共聚焦顯微術(shù)研究了羊肚菌菌核發(fā)育過程中的形態(tài)和生理變化,發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌核發(fā)育涉及了自噬、凋亡和壞死等事件,羊肚菌菌核的能量儲存物質(zhì)為脂肪;建立了羊肚菌栽培菌株身份(identity)、交配型(mating type)和活力(vitality)的IMV檢測技術(shù),可用于羊肚菌人工栽培菌株在大生產(chǎn)中的適應(yīng)性檢驗;優(yōu)化了羊肚菌原生質(zhì)體釋放和再生技術(shù),建立了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌種間雙滅活融合技術(shù),獲得了一批融合菌株,對推動羊肚菌原生質(zhì)體融合育種技術(shù)發(fā)展具有現(xiàn)實意義。主要研究結(jié)果如下:(1)對梯棱羊肚菌1號菌株,菌絲重復(fù)分枝和末端菌絲或亞末端菌絲分枝的擴大形成菌核原基,其菌核發(fā)育兼具末端型和側(cè)生型特性,為復(fù)合型;透射電子顯微術(shù)研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌核發(fā)育涉及了自噬、凋亡和壞死事件;活細(xì)胞共聚焦激光成像研究揭示了菌核中的能量儲存物質(zhì)為脂質(zhì)性質(zhì)。脂肪的定性測定表明,菌核中積累的脂肪多于營養(yǎng)菌絲細(xì)胞。(2)分別采用ITS-1/ITS-4、RPB1B-F/RPB1B-R、RPB2B-F/RPB2B-R引物對實驗室保存的6種羊肚菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增,測定了其ITS、RPB1B、RPB2B基因序列,并進(jìn)行了序列比對分析。結(jié)果表明,菌株4號和XuChang為梯棱羊肚菌(Morchella importuna),菌株201、13號、SZL-3號為六妹羊肚菌(Morchella sextelata),菌株CuBing與Morchella kaibabensis同源相似性為98.9%,可信度為100%。設(shè)計和篩選了羊肚菌交配型基因測定的特異性引物,發(fā)現(xiàn)引物對Mat1-1/Mat1-1-1可特異性鑒定六妹羊肚菌的交配型,引物對Mat1-1-1/Mat1-2-1能夠鑒定梯棱羊肚菌的交配型。采用篩選的引物對分別對測定的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增,發(fā)現(xiàn)每對引物均能擴增出1條清晰的條帶,并且混合引物均能擴增出兩個條帶。這些結(jié)果表明,篩選的引物對可用于六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的交配型分析,測試的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株均未發(fā)生交配型缺失,六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌均屬于典型的異宗結(jié)合真菌。測定了六個羊肚菌菌株的脂質(zhì)過氧化水平,評價菌株的衰老情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌株SZL-3和CuBing老化程度最高,菌株201、13號活力最強,菌株4號、XuChang老化程度介于二者之間。(3)對梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌原生質(zhì)體釋放條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,梯棱羊肚菌原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件為:穩(wěn)滲劑為0.6 M甘露醇,酶液體系為2%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶,菌齡為3 d。在該優(yōu)化條件下,梯棱羊肚菌原生質(zhì)體產(chǎn)量為1×10~6個/mL,原生質(zhì)體再生率可達(dá)1.8%。六妹羊肚菌原生質(zhì)體制備最佳條件為:穩(wěn)滲劑為0.6 M甘露醇,酶液體系為2%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶,菌齡為3 d。在該優(yōu)化條件下,六妹羊肚菌原生質(zhì)體產(chǎn)量為6.5×10~5個/mL,原生質(zhì)體再生率可達(dá)1.5%。(4)優(yōu)化了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌種間雙滅活原生質(zhì)體融合條件。結(jié)果表明,2種羊肚菌種間原生質(zhì)體融合的最優(yōu)條件為:原生質(zhì)體融合溫度25℃,溶液pH 8.0,CaCl_2終濃度50 mmol/L,融合劑PEG濃度25%。在優(yōu)化條件下,原生質(zhì)體融合率可達(dá)0.8%。(5)篩選了鑒定2種羊肚菌的特異性RAPD(random amplified polymorphism DNA,隨機擴增多態(tài)性DNA)分子標(biāo)記。測定了2親本及融合子的RAPD標(biāo)記,通過聚類分析發(fā)現(xiàn)雙親本與融合子可分為3大類群:第一類群包括親本梯棱羊肚菌(P1),第二類群包括所有融合子,第三類群包括親本六妹羊肚菌(P2)。16個融合子可以分為3組,其中1、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16為一組,4、7為一組,2、3為一組。這些結(jié)果表明,采用梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌種間雙滅活融合技術(shù)獲得的羊肚菌原生質(zhì)體融合子為真正的融合子。(6)分別選取融合子1號(R1)、融合子2號(R2)、融合子4號(R4)、和雙親本進(jìn)行培養(yǎng),比較每種融合子和雙親本菌株的菌落形態(tài)差異,發(fā)現(xiàn)梯棱羊肚菌(P1)、六妹羊肚菌(P2)、R1、R2、R4均產(chǎn)菌核且產(chǎn)量多,菌核形態(tài)均為點狀;按照菌絲生長速度,各菌株的排列順序為:R4P1P2R2R1,但5菌株生長速度相差不大;不同菌株的菌塊恢復(fù)時間不同,其中P2恢復(fù)時間最長,P1恢復(fù)時間最短,1號、2號和4號融合子介于二者之間;P1、R1、R2、R4的菌絲緊密、P2稀疏;所有菌株菌落邊緣均整齊。這些結(jié)果表明,2種羊肚菌的融合子為真正的融合菌株。(7)人工栽培發(fā)現(xiàn),融合子R1和R4子囊果形態(tài)上接近2號親本(P2,為六妹羊肚菌),R5和R8形態(tài)接近于1號親本(P1,為梯棱羊肚菌),而R2和R3介于兩親本之間。(8)人工栽培表明,2親本與6個融合子8個菌株產(chǎn)量之間均差異顯著,沒有任何融合子菌株產(chǎn)量超過P1親本菌株,而R2融合子產(chǎn)量低于P2親本,暗示在原生質(zhì)體融合育種中,親本的選擇很重要(P2親本已經(jīng)退化和老化);也同時說明,通過原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得高產(chǎn)菌株的局限性很大;但該技術(shù)在綜合親本其他優(yōu)良性狀的融合菌株選育方面具有較大潛力。
【圖文】：

鄭州輕工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文E3123 和 GME3124，GME3123 含有 4 個內(nèi)含子，編碼 488 個氨基酸，1688bE 3124 含有 5 個內(nèi)含子，編碼 512 個氨基酸，1825bp。BLASTx 分析表明E3123 與 GME3124 分別與 Tuber borchii 的假定蛋白(AIU38081.1)的氨基酸為 24%，21%[40]。這些 ORFs 與先前發(fā)表的交配型基因的同源物有很大不此，我們推測它們是僅在羊肚菌中發(fā)現(xiàn)的新的交配基因。對梯棱羊肚importuna、六妹羊肚菌 M.sextelata 的單子囊孢子種群進(jìn)行了分析，結(jié)果表 MAT1-1-1 和 MAT1-2-1 的等位位點的比例與 1:1 的比例沒有顯著差異。明，這兩種黑羊肚菌是異源的。

遷移率基團(HMG)蛋白(MAT1-2-1)[42]。相反，同宗交配型真菌可自我在沒有交配伴侶的情況下完成生殖周期。典型地，一個單一的純合體菌個單倍體核中含有兩個 MAT 基因（連鎖的或非連鎖的）[35, 42]。在過去，分子技術(shù)，特別是基因組測序技術(shù)的出現(xiàn)，為深入理解羊肚菌物種的和生殖方式鋪平了道路。羊肚菌為異宗結(jié)合食用菌，也就是說，必須有 2 種不同交配型發(fā)生親和具有 2 種交配型基因（Mat1-1-1 和 Mat 1-2-1）的菌株，才能用于人工單一交配型 Mat1-1-1 或 Mat 1-2-1）的菌株用于生產(chǎn)，存在較大的不出更加重要的是，羊肚菌交配型基因在羊肚菌子囊果中的分配不均一（圖，也就是說，靠單孢分離和組織分離獲得的菌種，存在著單一交配型基風(fēng)險，這樣的無效菌種用于生產(chǎn)，將使菇農(nóng)戶面臨著巨大的失敗風(fēng)險。產(chǎn)菌種進(jìn)行交配型檢測，只將同時具有 2 種交配型的菌種用于生產(chǎn)，對具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：鄭州輕工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S646.7

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本文編號：2690405