發(fā)布時(shí)間：2020-05-25 13:21

【摘要】：金柑(Kumquat)原產(chǎn)于我國,是蕓香科(Rutaceae)金柑屬(Fortunella)植物,為常綠灌木或小喬木。類黃酮是金柑果實(shí)中最重要的次生代謝產(chǎn)物之一,某些類黃酮成分具有清除人體內(nèi)產(chǎn)生的自由基,預(yù)防心腦血管疾病、抗衰老及抗癌等營養(yǎng)保健功效。類黃酮在植物中主要以糖基化的形式存在,糖基化修飾提升了類黃酮的穩(wěn)定性和水溶性,增加了其在植物體內(nèi)的積累。糖基化修飾主要由UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycosyltransferase,UGT)催化完成的。植物中UGT基因通常以基因家族的形式存在,且數(shù)量眾多。如何從這些家族成員中準(zhǔn)確篩選出參與類黃酮糖基化修飾的UGT,是功能研究中最為關(guān)鍵的一步。本研究以瀏陽金柑(Fortunella crassifolia Swingle)果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料,首先利用靶向代謝組學(xué)技術(shù)對金柑果實(shí)各發(fā)育時(shí)期類黃酮進(jìn)行了種類鑒定與相對定量分析,再通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選了高表達(dá)的UGT基因,并結(jié)合相應(yīng)生物信息學(xué)方法及代謝組實(shí)驗(yàn)確定了與金柑類黃酮合成相關(guān)的UGT候選基因,并完成了部分基因的克隆與測序工作。研究結(jié)果為進(jìn)一步的功能鑒定等研究奠定了一定的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)取得的主要結(jié)果如下:1.利用液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC G2-S QTOF)對瀏陽金柑果實(shí)類黃酮種類進(jìn)行了檢測,鑒定出了11種類黃酮,包括2種C-葡糖苷類黃酮、5種C-新橙皮糖苷類黃酮及4種O-新橙皮糖苷類黃酮,分別為維采寧-2(Apigenin-6,8-di-C-glucoside)、3',5'-雙碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素(3',5'-di-C-β-glucopyranosylphloretin)、木犀草素-8-C-新橙皮糖苷(Luteolin-8-CNeohesperidoside)、木犀草素-6-C-新橙皮糖苷(Luteolin-6-C-neohesperidoside)、芹菜素-8-C-新橙皮糖苷(Apigenin-8-C-neohesperidoside)、刺槐黃素-8-C-新橙皮糖苷(Acacetin-8-C-neohesperidosid)、刺槐黃素-6-C-新橙皮糖苷(Acacetin-6-C-neohesperidoside)、野漆樹苷(Apigenin7-O-neohesperidoside)、柚皮苷(Naringenin-7-O-neohesperidoside)、金柑苷(Acacetin7-O-neohesperidoside)、枸橘苷(Isosakuranetin7-O-neohesperidoside)。2.通過液相色譜峰面積,對瀏陽金柑果實(shí)中含量較高的5種類黃酮(3',5'-雙碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、芹菜素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黃素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黃素-6-C-新橙皮糖苷、金柑苷)做了相對定量分析,探討了其含量在瀏陽金柑果實(shí)各發(fā)育階段的變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn),芹菜素-8-C-新橙皮糖苷的含量在果皮中呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢,在果肉中整體呈下降趨勢;其他類黃酮的變化趨勢基本一致,整體呈下降趨勢,且前期下降較快;3',5'-雙碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素在瀏陽金柑果實(shí)整個(gè)發(fā)育過程中的含量最高;另外,結(jié)果顯示瀏陽金柑果皮中類黃酮的含量普遍高于果肉。3.通過高通量測序技術(shù)對6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期10個(gè)瀏陽金柑果實(shí)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,以克萊門氏小柑橘(Citrus clementine)的基因組為參考對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,最終獲得高表達(dá)基因11350個(gè)。利用克萊門氏小柑橘蛋白數(shù)據(jù)庫對上述基因進(jìn)行注釋及基序(Motif)檢測,最終界定49個(gè)高表達(dá)的FcUGT基因。4.基于轉(zhuǎn)錄組FPKM值分析基因表達(dá)模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同基因表達(dá)模式差異顯著。在果皮中,以花后99天為分界點(diǎn),將這49個(gè)FcUGT基因分為兩種表達(dá)模式。第一種模式包含了24個(gè)FcUGT基因,我們發(fā)現(xiàn)這些基因在“花后99天”,這個(gè)分界點(diǎn)之前有更高的表達(dá)量;第二種模式包含了25個(gè)FcUGT基因,這些基因在“花后99天”,這個(gè)分界點(diǎn)之后有更高的表達(dá)量。相較于果皮,49個(gè)基因中的大部分基因在果肉中呈現(xiàn)一個(gè)低表達(dá)模式。5.以49個(gè)FcUGT基因和39個(gè)功能已知UGT基因的編碼蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹,并結(jié)合瀏陽金柑果實(shí)中類黃酮糖元的種類及結(jié)構(gòu),對FcUGT基因功能進(jìn)行預(yù)測。發(fā)現(xiàn)其中25個(gè)高表達(dá)的UGT可能參與了類黃酮糖基化修飾,并完成了8個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶候選基因的克隆與測序工作。
【圖文】：

稱取上述過 40 目篩子后的粉末樣品 0.5g 于 10mL 離心管，加入 7mL 純甲醇，混勻，超聲破碎 30min（功率 60%，水溫 45℃），5000rpm 離心 15min，取上清液于 25mL 棕色容量瓶，殘?jiān)^續(xù)加入 7mL 純甲醇，重復(fù)提取 3 次，用甲醇定容至25mL，取適宜提取液，加入適量去離子水稀釋，過 0.2μm 膜，放 4℃冰箱備用。3.2.2 超高效液相色譜（UPLC）條件對于 UPLC 條件的確定，在楊瑩等（2016）研究的基礎(chǔ)上，作了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，提高了金柑果實(shí)中類黃酮物質(zhì)的分離效果，在 8min 之內(nèi)基本上能將提取出來的類黃酮全部分離開。如圖 3-1 所示，為瀏陽金柑果實(shí)一個(gè)時(shí)期類黃酮的液相色譜圖。具體色譜條件如下所示:UPLC 檢測使用 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1×100 mm, 1.7μm，Waters，美國）；流動相 A 為 0.01%甲酸，B 為乙腈；流速為 0.3 mL.min-1；柱溫：40℃；進(jìn)樣量為 1μL（每個(gè)樣品重復(fù)檢測 3 次）；檢測波長為 283nm、330nm、365nm；檢測范圍為 200nm-400nm。濃度梯度如下：0 min: 90% A+ 10% B; 2 min: 80% A+20% B; 5 min:75% A + 25% B; 9 min:65% A + 35% B。

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文20圖3-3 金柑果實(shí)中類黃酮的結(jié)構(gòu)。Nh代表新橙皮糖苷Fig.3-3 Structures for flavonoids found in fruits. Nh represents Neohesperidose3.3.3 瀏陽金柑果實(shí)各發(fā)育時(shí)期類黃酮的相對定量分析因?yàn)g陽金柑果實(shí)中含量較多的幾種類黃酮國內(nèi)無商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)品，為探討瀏陽金柑果實(shí)中各類黃酮含量的變化規(guī)律，本次實(shí)驗(yàn)通過最大吸收波長下液相色譜峰面積對含量較高的 5 種類黃酮（3',5'-雙碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、芹菜素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黃素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黃素-6-C-新橙皮糖苷、金柑苷）在瀏陽金柑各個(gè)發(fā)育時(shí)期的相對定量做了比較，，探討了這 5 種類黃酮含量在瀏陽金柑果實(shí)各個(gè)發(fā)育時(shí)期的變化規(guī)律。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S666.1;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2680211