【摘要】：種子是多數(shù)植物生命周期的開始。多年生木本植物種子往往存在休眠現(xiàn)象,以保證種子在適宜的時間、適宜的環(huán)境萌發(fā)。梨種子就存在休眠現(xiàn)象。目前關(guān)于梨種子休眠形成的分子機制還不清楚。NAC是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子,參與植物種子發(fā)育、次生細胞壁生長、果實成熟等多個生理過程。但其在種子休眠解除中的作用還未見報道。本論文以梨砧木豆梨種子為試驗材料,測定了豆梨種子發(fā)育過程中糖類物質(zhì)(葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉)和激素(GA和ABA)的變化情況,及休眠解除過程中活性氧及其代謝相關(guān)酶和激素(GA和ABA)變化情況,并利用反義寡聚核苷酸技術(shù)研究NAC轉(zhuǎn)錄因子在豆梨種子休眠解除中的作用機制,主要結(jié)果如下:1、確定9個NAC基因結(jié)構(gòu)特點。以參與豆梨種子休眠解除的miRNA164靶基因—9個NAC轉(zhuǎn)錄因子為對象,利用生物信息學方法,發(fā)現(xiàn)9個NAC基因所編碼的蛋白質(zhì)含有290-362個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量約為32604.7-40415.6 Da,等電點為6.1775-8.3422。其中PpNAC5、PpNAC134、PpNAC86、PpNAC42、PpNAC121、PpNAC34 和PpNAC138 為堿性氨基酸,PpNAC65和PpNAC145為酸性氨基酸。蛋白質(zhì)疏水性數(shù)值顯示只有PpNAC86是兩性氨基酸,其余8個NAC都是極性氨基酸。系統(tǒng)分類和功能預測表明,9個NAC蛋白屬于第Ⅱ類,PpNAC34和PpNAC138歸類于NAC1亞組,介導激素信號通路;其余NAC歸類于NAM亞組,其中PpNAC5、PpNAC134、PpNAC86可能與種子胚胎發(fā)育及萌發(fā)有關(guān)。2、確定豆梨種子在發(fā)育過程中的糖類物質(zhì)和激素的含量變化,以及該過程中NAC基因表達情況。在整個豆梨種子發(fā)育過程中,葡萄糖含量先大幅度降低隨后保持平穩(wěn),而蔗糖含量先大幅度增加隨后趨于穩(wěn)定,淀粉含量前期平穩(wěn)后期大幅度增加。ABA含量逐漸增加,而GA含量表現(xiàn)出降低—平穩(wěn)—降低的趨勢變化。綜合NAC表達情況,其中PpNAC65下調(diào)趨勢與GA類似,PpNAC34和PpNAC138的上調(diào)趨勢與ABA相似,暗示PpNAC34、PpNAC65和PpNAC138可能與豆梨種子發(fā)育進程有關(guān)。3、確定豆梨種子在休眠解除過程中的NAC基因表達情況,進一步確認PpNAC5、PpNAC65和PpNAC138在豆梨種子休眠解除過程中的作用。利用反義寡聚核苷酸技術(shù)分別抑制豆梨種子中相關(guān)NAC基因的表達。研究發(fā)現(xiàn),與正常層積的種子相比,抑制處理的種子不同程度提前萌發(fā)。當PpNAC表達被抑制,GA含量和ROS含量及其合成相關(guān)基因表達被顯著誘導;當PpNAC65表達被抑制,GA含量及其合成相關(guān)基因表達量顯著增加;當PpNAC138表達被抑制,ABA含量及其合成相關(guān)基因表達量顯著降低,而GA含量及其合成基因表達量顯著提高。推測PpNAC5可能通過參與GA和ROS合成途徑,PpNAC65通過調(diào)控GA合成途徑,而PpNAC138則參與GA和ABA合成途徑,從而調(diào)控豆梨種子休眠解除過程。通過上述研究,初步提供了NAC轉(zhuǎn)錄因子參與豆梨種子發(fā)育與休眠解除相關(guān)生理過程的證據(jù)。研究結(jié)果豐富了NAC基因家族成員在梨種子發(fā)育及休眠過程中的功能,也為生產(chǎn)上建立快速打破種子休眠,培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)高效生長梨種苗提供理論依據(jù)。
【圖文】：

ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子的主要特征是包含ＮＡＣ結(jié)構(gòu)域。典型的ＮＡＣ蛋白質(zhì)Ｎ端含有１５０逡逑多個高度保守的氨基酸殘基組成的ＮＡＣ結(jié)構(gòu)域，Ｃ端含有一個高度多樣化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控逡逑（ＴＲ）結(jié)構(gòu)域（圖１－ｌａ）邋［４８］。ＮＡＣ結(jié)構(gòu)域根據(jù)多重序列聯(lián)配的結(jié)果可被劃分為高度保逡逑守的Ａ、Ｃ、Ｄ和保守性較低的Ｂ、Ｅ這５個亞結(jié)構(gòu)域。其中，亞結(jié)構(gòu)域Ｃ和Ｄ可能與逡逑結(jié)合ＤＮＡ有關(guān)，Ａ可能參與同源和異源二聚體化，Ｂ、Ｅ可能與ＮＡＣ蛋白質(zhì)功能的多逡逑樣化有關(guān)，并協(xié)同Ｄ與ＤＮＡ發(fā)生相互作用［４９］。一些ＮＡＣ還存在保守的鋅指（ＺＦ）結(jié)逡逑構(gòu)（圖卜ｌｂ），邋ＺＦ是由保守氨基酸的小基團與鋅離子結(jié)合形成類似手指狀的ＤＮＡ結(jié)合逡逑結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合結(jié)構(gòu)域是ＮＡＣ與ＤＮＡ結(jié)合蛋白的一個保守基序。比如況４0？５０結(jié)合逡逑（Ｃ／Ｔ）邋Ａ邋（Ｃ／Ａ）邋Ｇ邋基序，Ｍ４Ｃ０７９、似（：０５５邋和}0＜：０７２邋結(jié)合邋ＣＡＣＧ邋基序／６Ｍ４Ｃ７逡逑結(jié)合甘薯貯藏蛋白啟動子中創(chuàng)傷反應(yīng)順式作用元件（ＳＷＲＥ）區(qū)域的特定基序是逡逑ＴＡＣＡＡＴＡＴＣ［５１］，ｒＵＣＭ吏用ＣＡ邋（Ｔ／Ａ）邋Ｇ共有序列來調(diào)節(jié)靶基因［５２］。對于擬南芥１０８逡逑個ＮＡＣＴＦｓ

孫婭ＮＡＣｓ在豆梨種子發(fā)育和休眠解除過程中的作用研究及應(yīng)用邐＾逡逑基酸序列，但是其氨基酸序列組成和長度的差異性均會導致它們基因功能不同。因此逡逑ＮＡＣ基因的生物學功能越相近，其保守結(jié)構(gòu)域的同源性越高。逡逑２．３梨ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子保守元件分析逡逑利用ＭＥＭＥ預測保守的Ｍｏｔｉｆｓ，進一步分析９個梨ＮＡＣ蛋白質(zhì)的多樣性（圖２－３）。逡逑根據(jù)得到的模序預測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，這９個ＮＡＣ蛋白序列皆包含保守元件ｍｏｔｉｆ邋１、ｍｏｔｉｆ逡逑２、ｍｏｔｉｆ４、ｍｏｔｉｆ邋５、ｍｏｔｉｆ邋８和ｍｏｔｉｆ邋９，且同源關(guān)系較近的蛋白質(zhì)有相似的ｍｏｔｉｆｓ組成。逡逑除了共有的保守元件，聚在同一亞族的和都額外包含ｍｏｔｉｆｌ８，同逡逑源關(guān)系相近的邐也都額外包含了邋ｍｏｔｉｆ６、ｍｏｔｉｆ７、ｍｏｔｉｆ邋１５、逡逑ｍｏｔｉｆ邋１７，這可能就是導致它們在功能上存在差異的原因。這２０邋ｔｍｏｔｉｆ的序列長度在逡逑６？５０之間（表２－２）。逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S661.2

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本文編號：2678557