【摘要】：為了實(shí)現(xiàn)柑橘無(wú)核育種目標(biāo),將帶CMS特性的愈傷原生質(zhì)體與有籽品種的葉肉原生質(zhì)體融合,實(shí)現(xiàn)CMS性狀的轉(zhuǎn)移,創(chuàng)制同時(shí)具有葉肉親本的優(yōu)良性狀和愈傷組織親本無(wú)籽特性的體細(xì)胞雜種/胞質(zhì)雜種。本研究有針對(duì)性地選擇溫州蜜柑作為懸浮系原生質(zhì)體親本與以多籽或有籽柑橘品種的葉肉原生質(zhì)融合,試圖通過(guò)對(duì)稱融合方式獲得轉(zhuǎn)移溫州蜜柑不育胞質(zhì)的體細(xì)胞雜種;同時(shí),充分利用本實(shí)驗(yàn)室已有的細(xì)胞學(xué)技術(shù)觀察原生質(zhì)體融合過(guò)程中細(xì)胞器的形態(tài)、數(shù)量和位置變化,特別是線粒體在原生質(zhì)體融合及細(xì)胞再生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。主要結(jié)果如下:1.‘國(guó)慶1號(hào)’溫州蜜柑(Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing No.1,G1)為愈傷懸浮系親本,分別與‘Nova’橘柚[C.reticulata Blanco×(C.reticulata Blanco×C.paradisi Macf.)]和紅暗柳橙(C.sinensis Osbeck cv.Red Anliu)葉肉原生質(zhì)體融合,獲得了G1+‘Nova’橘柚和G1+紅暗柳橙兩個(gè)組合的再生植株。G1+‘Nova’橘柚組合得到6棵再生植株,流式細(xì)胞儀檢測(cè)所有再生植株均為四倍體,分子標(biāo)記檢測(cè)再生植株具有雙親的核基因組。其中1、3和6號(hào)植株葉綠體基因組來(lái)自愈傷親本G1,2、4和5號(hào)植株的葉綠體基因組來(lái)自其葉肉親本。G1+紅暗柳橙組合獲得8棵再生植株,選取其中4棵進(jìn)行倍性分析和分子鑒定,流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)顯示1-3號(hào)為四倍體植株,4號(hào)為二倍體植株;分子標(biāo)記分析表明所有四倍體植株均包含雙親的核SSR特征帶,細(xì)胞質(zhì)基因組均來(lái)自愈傷組織親本,為異源體細(xì)胞雜種;二倍體植株的細(xì)胞核基因組與愈傷組織親本一致,為愈傷親本的再生植株。2.明場(chǎng)下對(duì)線粒體和葉綠體在融合過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞融合過(guò)程結(jié)束后,兩者不能立即完成融合,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,各種細(xì)胞器無(wú)法分辨。利用熒光標(biāo)記和熒光染料技術(shù)對(duì)融合子持續(xù)觀察,初步了解了融合過(guò)程中細(xì)胞器的形態(tài)變化過(guò)程。融合細(xì)胞中的葉綠體在培養(yǎng)7d后明顯減少,10d后幾乎完全消失,無(wú)法直接遺傳給子細(xì)胞,這個(gè)現(xiàn)象可能與葉肉原生質(zhì)體無(wú)法再生有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在7d左右恢復(fù)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在培養(yǎng)16d的再生細(xì)胞團(tuán)中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集于細(xì)胞壁。不同來(lái)源細(xì)胞中線粒體數(shù)量、形態(tài)和位置都有很大差異:葉肉原生質(zhì)體線粒體數(shù)量少,體積較大,基本位于葉綠體周圍;愈傷組織原生質(zhì)體線粒體數(shù)量多,體積較小,位于細(xì)胞膜和淀粉粒周圍。線粒體融合與分裂在細(xì)胞融合后即開始發(fā)生,16h后幾乎90%以上線粒體完成遺傳物質(zhì)的交換。
【圖文】：

3.1.2 再生植株的倍性分析以二倍體 G1 愈傷組織為對(duì)照，用流式細(xì)胞儀對(duì)所有再生植株進(jìn)行倍性分析。將二倍體對(duì)照調(diào)節(jié)其峰值在 49.86 （圖 2-A），在相同參數(shù)下對(duì)來(lái)自 G1 + ‘Nova’圖 1 G1 + ‘Nova’融合再生過(guò)程A. 在 60 mm×15mm 培養(yǎng)皿中形成的愈傷團(tuán)； B. 在 EME500 培養(yǎng)基上再生胚狀體；C. 畸形胚再生； D.胚狀體生芽； E. 芽誘導(dǎo)生根； F.移入溫室的再生植株Fig.1 Regeneration of hybrid plants from G1 + ‘Nova’ tangelo.A. Regeneration of callus clusters in 60 mm × 15 mm Petri dish; B. Green embryoids fromsome calluses in EME500 medium; C. Malformed embryoids regenerated; D. shoots weredeveloped from embryoids; E. Recovered shoots on solid induction medium; F.Regenerated tetraploid hybrid plant in greenhouse

圖 4 國(guó)慶 1 號(hào)溫州蜜柑與紅暗柳橙再生四倍體體細(xì)胞雜種A. 國(guó)慶 1 號(hào)溫州蜜柑的愈傷組織原生質(zhì)體與紅暗柳橙葉肉原生質(zhì)體融合； B. 培養(yǎng) 9天后在 60 mm × 15 mm 的培養(yǎng)皿中再生出愈傷組織； C. EME500 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 4 周后生胚狀體； D. 國(guó)慶 1 號(hào)與紅暗柳橙組合再生植株Fig. 4 Regeneration of tetraploid hybrid plants from G1 + ‘RedAnliu’orangcombinationA. The fusion between calli protoplasts of G1 and mesophyll protoplasts isolated from ‘RAnliu’ sweet orange; B. Regeneration of callus clusters in 35 mm × 15 mm Petri dish afabout 90 d of protoplast culture; C. Regenerated somatic embryoids after 4 w of culture EME500 medium; D. tetraploid hybrid plant from G1 + ‘Red Anliu’sweet orange in potsBars = 20 μm (A); 1 cm (B - D); 3 cm (E and F).
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S666

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐德林;儲(chǔ)士潤(rùn);潘胤池;鄭明輝;錢剛;陳芳;李林;;金釵石斛原生質(zhì)體的制備與融合[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2016年08期

2 吳貴英;祝飛;沈訪;儲(chǔ)士潤(rùn);李林;鄭明輝;;聚乙二醇誘導(dǎo)金釵石斛原生質(zhì)體融合條件的初步探索[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2016年04期

3 解凱東;王曉培;王惠芹;梁武軍;謝宗周;郭大勇;伊華林;鄧秀新;Grosser Jude W.;郭文武;;以柑橘多胚性二倍體母本倍性雜交培育三倍體[J];園藝學(xué)報(bào);2014年04期

4 梁武軍;解凱東;郭大勇;謝宗周;伊華林;郭文武;;10個(gè)柑橘砧木類型同源四倍體的發(fā)掘與SSR鑒定[J];果樹學(xué)報(bào);2014年01期

5 解凱東;王曉培;謝宗周;郭文武;;4個(gè)柑桔體細(xì)胞雜種砧木資源的種子特性評(píng)價(jià)[J];中國(guó)南方果樹;2013年05期

6 Michael B Sheahan;Ray J Rose;David W McCurdy;;Mechanisms of Organelle Inheritance in Dividing Plant Cells[J];Journal of Integrative Plant Biology;2007年08期

7 ;RAPD-based genetic analysis of offsprings from the sexual cross using allotetraploid citrus somatic hybrid as pollen parent[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2007年03期

8 付春華,文曉鵬,郭文武,鄧秀新;國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株[J];山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào);2004年02期

9 程運(yùn)江,郭文武,鄧秀新;葉綠體SSR標(biāo)記:柑橘體細(xì)胞雜種胞質(zhì)遺傳分析的一種新方法(英文)[J];Acta Botanica Sinica;2003年08期

10 張俊娥,劉繼紅,鄧秀新;采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異[J];遺傳學(xué)報(bào);2003年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 蔡小東;柑橘雄性不育胞質(zhì)雜種創(chuàng)造及相關(guān)基礎(chǔ)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

2 宋健坤;柑橘三倍體種質(zhì)資源的創(chuàng)造及遺傳分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

3 張俊娥;柑橘愈傷組織DNA含量變異、體細(xì)胞胚胎發(fā)生及同源四倍體的誘導(dǎo)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王惠芹;以新開花的異源四倍體體細(xì)胞雜種為父本與二倍體雜交培育三倍體柑橘[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：2678198