發(fā)布時(shí)間：2020-05-23 13:45

【摘要】：中國是一個(gè)氣候多樣的大陸國家,擁有比其他國家更豐富的梨屬種質(zhì)資源。梨屬(Pyrus)起源于中國西部和西南部的山區(qū),而中國東部和中亞被認(rèn)為是梨的遺傳多樣性的兩個(gè)亞中心。最近,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心完成了對(duì)亞洲梨之一的中國白梨(Pyrus bretschneideri Rehd)的完整基因組測(cè)序。梨基因組的解碼,使梨幾乎所有的基因序列變?yōu)榧褐?為梨的生物學(xué)研究提供了新的資源。通過全基因組功能和比較研究使得研究人員能夠深入了解生物機(jī)制以及鑒定出的新的基因家族。關(guān)于植物轉(zhuǎn)錄因子的現(xiàn)有研究大多數(shù)來自擬南芥(Arabidopsis thaliana),其具有2,296個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因,分為58個(gè)家族,而在梨中已經(jīng)鑒定了 42,812子基因。迄今為止,學(xué)者對(duì)梨的9個(gè)基因家族和4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了全基因組分析,目前對(duì)潛在轉(zhuǎn)錄因子的研究非常有限,因此需要對(duì)涉及梨的果實(shí)著色,非生物脅迫耐受性和芽休眠的植物發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行全基因組分析。因此,基于我們之前的研究,我們選擇梨中的CBF/DREB和NAC轉(zhuǎn)錄因子,在亞洲梨中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育,結(jié)構(gòu),調(diào)控和功能鑒定研究。CBF/DRE轉(zhuǎn)錄因子在多種適應(yīng)性機(jī)制,分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)植物非生物脅迫的耐受性方面發(fā)揮作用。在梨和其他薔薇科作物中,需要研究CBF亞家族的獨(dú)立進(jìn)化,以了解它們可能的不同功能。我們從梨基因組中發(fā)現(xiàn)了 15個(gè)PpPCBF,但序列的相似性0.90,對(duì)于那些具有類似的系統(tǒng)發(fā)育分支(PpyCBFs 7,8,9,10,11,12,13,14)、不完整序列(PpyCBF12)和在 Scaffold上(PpyCF7,8,10,11,13,14,15)的基因沒有進(jìn)行后續(xù)研究,而我們選擇其保守序列即PpyCBFsl-6開展進(jìn)一步研究。系統(tǒng)發(fā)育樹將PpyCBF分成三個(gè)主要的進(jìn)化枝/亞型,有趣的是PpyCBF與其他薔薇科植物一起顯示出與模式作物擬南芥AtCBFs的獨(dú)立進(jìn)化。第一進(jìn)化枝不僅具有來自雙子葉植物和單子葉植物作物的CBF,而且還具有PpyCBF3共線性基因,其表明PpyCBF3可能是祖先CBF,而所有其他CBF在梨的全基因組復(fù)制(WGD)過程中從PpCBF3進(jìn)化而來。對(duì)所有6個(gè)PpyCBF在非生物脅迫(低溫,鹽和干旱),外源ABA和芽?jī)?nèi)休眠期間的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,所有PpyCBF基因表達(dá)均被誘導(dǎo),但對(duì)各種脅迫,ABA處理和芽?jī)?nèi)休眠過程的響應(yīng)有所差異。這些CBF表達(dá)模式類似于脅迫響應(yīng)相關(guān)基因PpyCOR(PpyCOR47,PpyCOR15A,PpyRD29A和PpyKIN)。第二枝PpyCBFs在低溫和ABA處理期間顯示出更高的轉(zhuǎn)錄水平,而發(fā)現(xiàn)Ⅰ和Ⅲ進(jìn)化枝更多的是響應(yīng)鹽和干旱反應(yīng)。啟動(dòng)子分析顯示,I(PpyCBF3)和Ⅲ進(jìn)化枝(PpyCBF5)CBF缺乏G-boxl順式元件,存在ABRE順式元件,表明它們僅受ABI3/VP1級(jí)聯(lián)調(diào)控,而Ⅱ進(jìn)化枝PpyCBF受到b-ZIP和ABI3轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。在擬南芥中異位表達(dá)PpyCBF2和PpyCBF3增強(qiáng)了其對(duì)非生物脅迫(尤其是低溫(PpCBF2)以及鹽和干旱脅迫(PpyCBF3)、更低的ROS的耐受性,并增加了抗氧化基因活性。正常生長(zhǎng)條件下,在PpyCBF2、3過表達(dá)擬南芥中,依賴內(nèi)源性ABA(AtABF2和AtRD29BA和不依賴ABA的(AtCOR47,AtCOR15A和AtRD29A)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)增加,表明PpyCBF發(fā)揮功能可能擁有依賴ABA和不依賴于ABA的兩條途徑。所有PpyCBF尤其是祖先CBF具有6X CCGAC結(jié)合元件的高反式激活活性。通過熒光素酶和酵母單雜交實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)所有CBF均與PpyCOR47和PpyCOR15A(PpyCBF6除外)發(fā)生互作,而Ⅱ進(jìn)化枝PpyCBF對(duì)PpyRD29A具有高于Ⅰ和Ⅲ進(jìn)化枝PpyCBF的調(diào)控作用。先前鑒定的'CCGA'結(jié)合位點(diǎn)和PpyCOOR15A啟動(dòng)子中'CGACA'結(jié)合位點(diǎn)的突變顯示'CGA'是梨中PpyCBF的核心結(jié)合元件�？傊�,PpyCBF轉(zhuǎn)錄因子可能通過依賴ABA和不依賴ABA兩條途徑冗余地發(fā)揮作用,并且與亞洲梨的非生物脅迫信號(hào)和響應(yīng)密切相關(guān)。NAC蛋白在不同的植物發(fā)育過程以及對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性中發(fā)揮作用。梨基因組的解碼為找到PpNAC轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化、復(fù)制、基因結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)功能的全基因組分析提供了基礎(chǔ)。我們?cè)诶嬷泄舶l(fā)現(xiàn)185個(gè)PpNAC基因,其中148個(gè)位于染色體上,37個(gè)位于未組裝的Scaffold上。在11號(hào)染色體上觀察到最大PpNAC基因頻率(11%),隨后是10號(hào)染色體(9%),而16號(hào)和7號(hào)染色體(1%和1.6%)展現(xiàn)出最小的頻率。通過系統(tǒng)發(fā)育分析,我們將NAC基因分為6個(gè)進(jìn)化枝(第1組-第6組)及其亞進(jìn)化枝(亞組A至亞組H),而第1組是最大的,有40個(gè)PpNAC基因和8個(gè)亞組(1A-1H),其次是第2組和第6組,分別具有34個(gè)基因和4個(gè)(2A-2D)和3個(gè)(6A-6C)亞組�；蚪Y(jié)構(gòu)和基序分析表明,具有相似基因結(jié)構(gòu)和基序的NAC蛋白存在于相同的亞組中,每組顯示共同的基序,沒有/微小的變化使其具有相似的功能。每組的外顯子數(shù)量從1到12不等,平均為3個(gè)外顯子。在亞洲梨中有44對(duì)重復(fù)的NAC。不同梨品種/種的qPCR和RNA-Seq數(shù)據(jù)分析驗(yàn)證了 PpNAC基因的一些預(yù)測(cè)功能,即PpNAC 37,61,70(2A,53,151(2D),10,92,130和154(3D)是可能參與芽休眠,PpNA 61,70(2A),172,176和23(4E)與藍(lán)光下果實(shí)色素沉著有關(guān),PpNACs127(1E),46(1G)和56(5A)可能分別與早期、中后期果實(shí)發(fā)育有關(guān)。此外,通過針對(duì)梨中的應(yīng)激反應(yīng)基因,發(fā)現(xiàn)來自亞組2D和3D的所有基因與非生物脅迫(冷,鹽和干旱)耐受性相關(guān)。目前全基因組分析為了解梨和高等植物中NAC基因家族的分類,基序和基因結(jié)構(gòu),進(jìn)化和預(yù)測(cè)功能提供了有價(jià)值的信息�？傊�,PpNAC轉(zhuǎn)錄因子在梨的非生物脅迫耐受性,果實(shí)發(fā)育和成熟,果實(shí)后熟和著色以及芽休眠等多條途徑中扮演著不同的角色。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S661.2

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