【摘要】：番茄是我國北方地區(qū)廣泛種植的蔬菜作物。作為一種喜溫蔬菜,番茄在冬春季節(jié)極易受低溫傷害,從而影響產(chǎn)量與品質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟損失。低溫脅迫分為冷害(0-10℃)和凍害(0℃以下)。番茄遭受冷害時會積累大量活性氧,造成膜脂過氧化,并且冷害還會對番茄的光合機構(gòu)和光合作用造成嚴(yán)重的影響,導(dǎo)致其生長發(fā)育遲緩、座果率下降、畸形果數(shù)量增加,嚴(yán)重時會導(dǎo)致植株死亡�；ㄇ嗨厥且环N天然的水溶性色素,因其具有抗氧化能力,所以在一定程度上能緩解低溫對番茄的傷害�；ㄇ嗨氐暮铣墒艿蕉鄠�基因的調(diào)控和多種環(huán)境因素的影響,調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子主要包括MYB、bHLH、WD40等家族。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,在不同植物中參與多種生理生化過程的調(diào)節(jié),并且MYB轉(zhuǎn)錄因子家族還參與植物對低溫等逆境脅迫的響應(yīng)。番茄基因組中共有127個MYB轉(zhuǎn)錄因子,目前關(guān)于它們功能的報道還較少。本實驗從番茄中分離得到了一個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因(SlMYB113),以過表達SlMYB113的轉(zhuǎn)基因番茄與野生型植株為實驗材料,研究了該基因?qū)Ψ训蜏乜剐约暗蜏孛{迫下花青素合成過程的影響。該研究結(jié)果對于闡明MYB轉(zhuǎn)錄因子在番茄低溫抗性中的功能具有重要意義。主要研究結(jié)果如下:(1)根據(jù)SGN網(wǎng)站(https://solgenomics.net/)上已知的SlMYB113的基因序列設(shè)計引物,以番茄的cDNA為模板,通過PCR反應(yīng)獲得SlMYB113基因的全長。SlMYB113基因全長950 bp,開放閱讀框780 bp,編碼259個氨基酸。氨基酸同源比對和進化樹分析發(fā)現(xiàn)SlMYB113屬于R2R3型的MYB轉(zhuǎn)錄因子。(2)構(gòu)建SlMYB113-GFP載體和SlMYB113-FLAG載體,分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101和LBA4404,將含有SlMYB113-GFP質(zhì)粒的GV3101和含有SlMYB113-FLAG質(zhì)粒的LBA4404分別瞬時轉(zhuǎn)化煙草和在番茄中穩(wěn)定表達,然后分別通過激光共聚焦顯微鏡觀察和Western-blot分析SlMYB113蛋白的亞細(xì)胞定位,結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞核。(3)通過qRT-PCR分析了SlMYB113在不同脅迫下的表達模式,發(fā)現(xiàn)SlMYB113受低溫、干旱等脅迫和赤霉素等信號分子的誘導(dǎo)表達。組織表達分析結(jié)果表明SlMYB113在葉片中的表達量最高。(4)構(gòu)建pBI121-SlMYB113的過表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄,獲得過表達SlMYB113的轉(zhuǎn)基因番茄植株,對轉(zhuǎn)基因株系進行篩選鑒定并選取表達量高的OE-8、OE-11和OE-22株系進行后續(xù)的實驗。(5)與野生型相比,在正常條件和低溫處理下,過表達SlMYB113的轉(zhuǎn)基因番茄葉片中花青素的積累顯著增加,使葉片背面呈現(xiàn)明顯的紫色。而且一些花青素合成相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達被明顯上調(diào),這說明SlMYB113參與了番茄花青素合成過程的調(diào)控。(6)低溫脅迫下,轉(zhuǎn)基因SlMYB113番茄和野生型的MDA積累量和REC都上升,轉(zhuǎn)基因番茄的增加量低于野生型,這說明在低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因番茄的細(xì)胞膜受損程度低,低溫耐受力高。在低溫脅迫下,轉(zhuǎn)基因番茄的活性氧積累量比野生型低,但是轉(zhuǎn)基因番茄中的抗氧化酶活性比野生型弱,這說明轉(zhuǎn)基因番茄中的活性氧可能被花青素清除。(7)通過酵母單雜交實驗和轉(zhuǎn)錄激活實驗證明了SlWHY1能與SlMYB113互作,SlWHY1能結(jié)合在SlMYB113基因的啟動子上,并且能促進SlMYB113的表達。這說明SlMYB113是SlWHY1的下游靶基因。實驗結(jié)論:我們從番茄中分離得到了一個R2R3類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子SlMYB113。該基因全長980 bp,開放閱讀框全長780 bp,編碼259個氨基酸。該基因的產(chǎn)物定位于細(xì)胞核;SlMYB113的表達受低溫、干旱和赤霉素等多種脅迫和激素誘導(dǎo),且在葉片中表達量最高;過表達SlMYB113增加花青素的積累,從而提高了轉(zhuǎn)基因番茄的低溫抗性;SlMYB113是SlWHY1的下游靶基因。
【圖文】：

素主要通過清除氧自由基提高植物的低溫、干旱等逆境脅迫的耐受能力，保護植物免受傷害（Hatieratier et al., 2013）。圖1-1 花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)（王輝等，2009）Fig.1-1 Chemical construction of anthocyanidin (Wang et al., 2009)1.2.2 花青素生物合成途徑花青素的生物合成途徑分為以下三個階段（圖1-2）：第一階段：苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）使苯丙氨酸脫 氨 形 成 肉 桂 酸 （ trans-cinnamic acid ） ， 肉 桂 酸 4- 羥 化 酶 （ cinnamic acid4-hydroxylase, C4H）使肉桂酸羥化生成p-香豆酸（p-coumaric acid），p-香豆酸通過4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaric acid CoA ligase, 4CL）的催化生成p-香豆酰輔酶A；在乙酰輔酶A連接酶(acetyl-Co A ligase, ACL）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）的共同作用下使乙酸生成丙二酰輔酶A（Spelt et al.2000）。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文11圖1-2 花青素合成途徑（梁等，2018）Fig.1-2 Synthetic pathway of anthocyanidin（liang et al.,2018）1.2.3 花青素合成的分子調(diào)控機制花青素的合成過程受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，例如：MYB、bHLH、WD40、bZIP和WRKY等（Nakatsuka et al., 2005）。參與調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子主要集中在MYB、bHLH和WD40這三個轉(zhuǎn)錄因子家族中。MYB轉(zhuǎn)錄因子中參與花青素生物合成過程的主要是R2R3和R3這兩種類型（Lin etal., 2010）。棉花中的兩個R2R3類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子GhMYB10和GhMYB36與擬南芥中的AtTT2高度同源，能激活花青素合成相關(guān)基因的表達促使棉花花青素過量積累（Lu etal., 2017）。水芹菜中的OjMYB1作為一個R2R3類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合到 AtTT8和 AtEGL3的啟動子上并上調(diào)花青素合成相關(guān)基因的表達，使水芹菜呈現(xiàn)出花青素過量積累的表型（Feng et al., 2018）。胡蘿卜中的DcMYB6過表達會導(dǎo)致胡蘿卜主根中的花青素過量積累，種子和葉片中花青素含量升高（Xu et al., 2017）。bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，，其特征是含有一個與DNA結(jié)合的
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S641.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 賈趙東;馬佩勇;邊小峰;楊清;郭小丁;謝一芝;;植物花青素合成代謝途徑及其分子調(diào)控[J];西北植物學(xué)報;2014年07期

2 朱素琴;何玲艷;張千千;季本華;;植物細(xì)胞內(nèi)ROS的種類及其產(chǎn)生部位[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年34期

3 葛翠蓮;黃春輝;徐小彪;;果實花青素生物合成研究進展[J];園藝學(xué)報;2012年09期

4 李天來;張艷玲;趙康龍;;鈣處理對夜間亞低溫脅迫下薄皮甜瓜生長的影響[J];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2011年02期

5 王輝;龔淑英;劉蕾;;花青素分布、合成和降解綜述[J];茶葉;2009年04期

本文編號：2661597