【摘要】：番茄是我國(guó)北方地區(qū)廣泛種植的蔬菜作物。作為一種喜溫蔬菜,番茄在冬春季節(jié)極易受低溫傷害,從而影響產(chǎn)量與品質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。低溫脅迫分為冷害(0-10℃)和凍害(0℃以下)。番茄遭受冷害時(shí)會(huì)積累大量活性氧,造成膜脂過(guò)氧化,并且冷害還會(huì)對(duì)番茄的光合機(jī)構(gòu)和光合作用造成嚴(yán)重的影響,導(dǎo)致其生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、座果率下降、畸形果數(shù)量增加,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植株死亡�；ㄇ嗨厥且环N天然的水溶性色素,因其具有抗氧化能力,所以在一定程度上能緩解低溫對(duì)番茄的傷害�；ㄇ嗨氐暮铣墒艿蕉鄠�(gè)基因的調(diào)控和多種環(huán)境因素的影響,調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子主要包括MYB、bHLH、WD40等家族。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,在不同植物中參與多種生理生化過(guò)程的調(diào)節(jié),并且MYB轉(zhuǎn)錄因子家族還參與植物對(duì)低溫等逆境脅迫的響應(yīng)。番茄基因組中共有127個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子,目前關(guān)于它們功能的報(bào)道還較少。本實(shí)驗(yàn)從番茄中分離得到了一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因(SlMYB113),以過(guò)表達(dá)SlMYB113的轉(zhuǎn)基因番茄與野生型植株為實(shí)驗(yàn)材料,研究了該基因?qū)Ψ训蜏乜剐约暗蜏孛{迫下花青素合成過(guò)程的影響。該研究結(jié)果對(duì)于闡明MYB轉(zhuǎn)錄因子在番茄低溫抗性中的功能具有重要意義。主要研究結(jié)果如下:(1)根據(jù)SGN網(wǎng)站(https://solgenomics.net/)上已知的SlMYB113的基因序列設(shè)計(jì)引物,以番茄的cDNA為模板,通過(guò)PCR反應(yīng)獲得SlMYB113基因的全長(zhǎng)。SlMYB113基因全長(zhǎng)950 bp,開(kāi)放閱讀框780 bp,編碼259個(gè)氨基酸。氨基酸同源比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)SlMYB113屬于R2R3型的MYB轉(zhuǎn)錄因子。(2)構(gòu)建SlMYB113-GFP載體和SlMYB113-FLAG載體,分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101和LBA4404,將含有SlMYB113-GFP質(zhì)粒的GV3101和含有SlMYB113-FLAG質(zhì)粒的LBA4404分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草和在番茄中穩(wěn)定表達(dá),然后分別通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察和Western-blot分析SlMYB113蛋白的亞細(xì)胞定位,結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞核。(3)通過(guò)qRT-PCR分析了SlMYB113在不同脅迫下的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)SlMYB113受低溫、干旱等脅迫和赤霉素等信號(hào)分子的誘導(dǎo)表達(dá)。組織表達(dá)分析結(jié)果表明SlMYB113在葉片中的表達(dá)量最高。(4)構(gòu)建pBI121-SlMYB113的過(guò)表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄,獲得過(guò)表達(dá)SlMYB113的轉(zhuǎn)基因番茄植株,對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行篩選鑒定并選取表達(dá)量高的OE-8、OE-11和OE-22株系進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。(5)與野生型相比,在正常條件和低溫處理下,過(guò)表達(dá)SlMYB113的轉(zhuǎn)基因番茄葉片中花青素的積累顯著增加,使葉片背面呈現(xiàn)明顯的紫色。而且一些花青素合成相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)被明顯上調(diào),這說(shuō)明SlMYB113參與了番茄花青素合成過(guò)程的調(diào)控。(6)低溫脅迫下,轉(zhuǎn)基因SlMYB113番茄和野生型的MDA積累量和REC都上升,轉(zhuǎn)基因番茄的增加量低于野生型,這說(shuō)明在低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因番茄的細(xì)胞膜受損程度低,低溫耐受力高。在低溫脅迫下,轉(zhuǎn)基因番茄的活性氧積累量比野生型低,但是轉(zhuǎn)基因番茄中的抗氧化酶活性比野生型弱,這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因番茄中的活性氧可能被花青素清除。(7)通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)證明了SlWHY1能與SlMYB113互作,SlWHY1能結(jié)合在SlMYB113基因的啟動(dòng)子上,并且能促進(jìn)SlMYB113的表達(dá)。這說(shuō)明SlMYB113是SlWHY1的下游靶基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:我們從番茄中分離得到了一個(gè)R2R3類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子SlMYB113。該基因全長(zhǎng)980 bp,開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)780 bp,編碼259個(gè)氨基酸。該基因的產(chǎn)物定位于細(xì)胞核;SlMYB113的表達(dá)受低溫、干旱和赤霉素等多種脅迫和激素誘導(dǎo),且在葉片中表達(dá)量最高;過(guò)表達(dá)SlMYB113增加花青素的積累,從而提高了轉(zhuǎn)基因番茄的低溫抗性;SlMYB113是SlWHY1的下游靶基因。
【圖文】：

素主要通過(guò)清除氧自由基提高植物的低溫、干旱等逆境脅迫的耐受能力，保護(hù)植物免受傷害（Hatieratier et al., 2013）。圖1-1 花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)（王輝等，2009）Fig.1-1 Chemical construction of anthocyanidin (Wang et al., 2009)1.2.2 花青素生物合成途徑花青素的生物合成途徑分為以下三個(gè)階段（圖1-2）：第一階段：苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）使苯丙氨酸脫 氨 形 成 肉 桂 酸 （ trans-cinnamic acid ） ， 肉 桂 酸 4- 羥 化 酶 （ cinnamic acid4-hydroxylase, C4H）使肉桂酸羥化生成p-香豆酸（p-coumaric acid），p-香豆酸通過(guò)4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaric acid CoA ligase, 4CL）的催化生成p-香豆酰輔酶A；在乙酰輔酶A連接酶(acetyl-Co A ligase, ACL）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）的共同作用下使乙酸生成丙二酰輔酶A（Spelt et al.2000）。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文11圖1-2 花青素合成途徑（梁等，2018）Fig.1-2 Synthetic pathway of anthocyanidin（liang et al.,2018）1.2.3 花青素合成的分子調(diào)控機(jī)制花青素的合成過(guò)程受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，例如：MYB、bHLH、WD40、bZIP和WRKY等（Nakatsuka et al., 2005）。參與調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子主要集中在MYB、bHLH和WD40這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中。MYB轉(zhuǎn)錄因子中參與花青素生物合成過(guò)程的主要是R2R3和R3這兩種類型（Lin etal., 2010）。棉花中的兩個(gè)R2R3類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子GhMYB10和GhMYB36與擬南芥中的AtTT2高度同源，能激活花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)促使棉花花青素過(guò)量積累（Lu etal., 2017）。水芹菜中的OjMYB1作為一個(gè)R2R3類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合到 AtTT8和 AtEGL3的啟動(dòng)子上并上調(diào)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，使水芹菜呈現(xiàn)出花青素過(guò)量積累的表型（Feng et al., 2018）。胡蘿卜中的DcMYB6過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胡蘿卜主根中的花青素過(guò)量積累，種子和葉片中花青素含量升高（Xu et al., 2017）。bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，，其特征是含有一個(gè)與DNA結(jié)合的
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S641.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2661597