【摘要】：黃瓜是世界性的重要蔬菜作物之一,在全球蔬菜供應(yīng)中具有舉足輕重的地位。但是由于遺傳因素或者管理不善,果實中會積累苦味,嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益�？辔妒怯梢环N高度氧化的三萜化合物-葫蘆素導(dǎo)致的,廣泛存在于黃瓜、甜瓜、西瓜、南瓜和西葫蘆等葫蘆科植物中。葫蘆素不僅能夠抵抗病蟲害而且還具有良好的抗腫瘤活性。本研究綜合利用基因組、變異組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組分析手段,并結(jié)合分子生物學(xué)、生物化學(xué)等方法,揭示了9個基因負(fù)責(zé)黃瓜苦味物質(zhì)葫蘆素C生物合成的代謝路徑,包括1個OSC(Bi)基因、7個細(xì)胞色素P450基因和1個乙�；D(zhuǎn)移酶(ACT)基因,其中5個基因在6號染色體上構(gòu)成了一個基因簇,這9個合成基因在黃瓜葉片和野生果實中共表達(dá),與葫蘆素的組織分布一致。經(jīng)過功能驗證,完全解析了四步合成路徑,其中Bi負(fù)責(zé)催化葫蘆素C合成的第一步,環(huán)化2,3-氧化角鯊烯生成葫蘆二烯醇;兩個P450基因Csa3G903540和Csa6G088160分別負(fù)責(zé)催化葫蘆素C合成的第二步和第三步;ACT基因Csa6G088700負(fù)責(zé)催化葫蘆素C合成的最后一步。同時發(fā)現(xiàn)兩個bHLH型轉(zhuǎn)錄因子Bl(Bitter leaf)和Bt(Bitter fruit)能夠直接調(diào)控這9個合成基因的表達(dá),其中Bl控制著黃瓜葉片中苦味的合成,Bt控制著黃瓜果實中苦味的合成。在野生黃瓜向栽培黃瓜馴化過程中,控制果實苦味的Bt基因受到選擇。Bt基因啟動子上的兩個關(guān)鍵突變:SV-2195和SNP-1601,是黃瓜果實無苦味馴化的關(guān)鍵因素。除此之外,我們利用共表達(dá)、共調(diào)控的方法發(fā)現(xiàn)了一個ATP-binding cassette(ABC)家族的轉(zhuǎn)運蛋白基因CsABC1,該基因定位的黃瓜葉片中細(xì)胞的液泡膜上,依靠H~+離子驅(qū)動,負(fù)責(zé)將葫蘆素C從細(xì)胞質(zhì)運輸?shù)揭号葜�。并采用酵母微粒體囊泡轉(zhuǎn)運體系以及蟾蜍卵母細(xì)胞表達(dá)體系對CsABC1的功能進(jìn)行了驗證,這是首次在植物中克隆三萜化合物轉(zhuǎn)運蛋白,將為植物三萜的運輸研究提供指導(dǎo)作用。本論文的發(fā)現(xiàn)不僅幫助育種家進(jìn)行分子輔助育種,并且可以效仿抗瘧疾藥物青蒿素的代謝工程方法,利用合成生物學(xué)手段實現(xiàn)葫蘆素工業(yè)化生產(chǎn),也將為新藥開發(fā)提供新的思路。
【圖文】：

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言1997 年，F(xiàn)rey 等第一次報道了基因簇參與了玉米中抗性物質(zhì)的代謝路徑合成(Frey et al.,1997) �；虼赜� 5 個相鄰的基因構(gòu)成 (Bx1-Bx5) ，連續(xù)催化并合成 cyclic hydroxamic acid2,4-dihydroxy-1,4-benzoxazin-3-one (DIBOA)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)另外 4 個基因(Bx6-Bx9)能夠?qū)IBOA 轉(zhuǎn)化成 2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one (DIMBOA)，并將其糖苷化，其中三個基因(Bx6-Bx8)構(gòu)成了一個基因簇(Von et al., 2001; Frey et al., 2003; Jonczyk et al., 2008)。幾年后，發(fā)現(xiàn)了燕麥中的燕麥根皂苷合成基因簇(Qi et al., 2004)和水稻中的植物抗毒素的合成基因簇(Wilderman et al., 2004)。截止到 2014 年，已經(jīng)報道了 13 篇基因簇參與植物代謝產(chǎn)物的合成(Fieldet al., 2011; Field et al., 2008; Shimura et al., 2007; Takos et al., 2011; Winzer et al., 2012; Matsuba etal., 2013; Itkin et al., 2013)。這些合成基因簇在多種植物中被發(fā)現(xiàn)，包括單子葉植物和雙子葉植物，能夠合成不同類型的代謝產(chǎn)物，包括萜類，生物堿和生氰糖苷(圖 1.1)。這些基因簇的共同點是在染色體上至少有 3 個非同源的基因相鄰。首先發(fā)現(xiàn)一個關(guān)鍵酶基因，能夠催化形成前體，然后一系列的酶對前體進(jìn)行修飾，最終生成終產(chǎn)物(Osbourn, 2010)�；虼刂械幕驊�(yīng)該是從祖先代謝基因直接或者間接復(fù)制而來，因此人們開始利用比較基因組學(xué)分析基因簇形成的機(jī)制。

lycopersicon); (f) The diterpenes momilactone A and phytocassanes A-E (rice; O. sativa); (g) The alkaloid noscapine(poppy; P. somniferum); (h) The triterpene avenacin A-1 (oat; Avena spp.).目前報道的基因簇在染色體上的物理區(qū)間大小在35Kb-270Kb之間，含有3-10個基因(圖1.2)。有些基因簇中，含有未知功能的基因，并未參與目的產(chǎn)物的合成，比如百脈根中的合成生氰糖苷的基因簇。而其他參與合成代謝的基因簇，在染色體上排列緊密，沒有多余基因，比如燕麥中的燕麥皂苷合成基因簇和擬南芥中的 thalianol 合成基因簇(Qi et al., 2004; Field et al., 2008; Takos etal., 2011; Matsuba et al., 2013)�；虼刂械幕虮磉_(dá)模式通常是一致的，但是基因簇中的基因在一些特殊條件下可以獨立轉(zhuǎn)錄(Takos et al., 2011; Matsuba et al., 2013; Wegel et al., 2009)。但是水稻中多功能的 phytocassane 基因簇卻不同，兩個基因簇之間相互重疊，形成一個大的基因簇，但是大的基因簇中的基因表達(dá)水平與小基因簇中的基因表達(dá)水平不一致(Okada et al., 2007; Wang et al.,2012)。獨立于基因簇外的其他共表達(dá)基因，可能參與中間產(chǎn)物的合成，而非終產(chǎn)物，這些基因只有在特定條件下特定組織中才發(fā)揮作用。而且還可能參與了其他代謝產(chǎn)物的合成。有趣的是，番茄和馬鈴薯中的生物堿合成基因都分成了兩個基因簇，分布在不同的染色體上，并且共調(diào)控(Itkinet al., 2013)。大多數(shù)的基因簇應(yīng)該是在近期的進(jìn)化事件中產(chǎn)生的
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S642.2

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本文編號：2659672