【摘要】：根皮苷(根皮素2'-O-葡萄糖苷)是蘋果(Malus×domestica)中最主要的二氫查爾酮,也是含量最高的酚類化合物。在蘋果葉片中,根皮苷含量可高達(dá)可溶性總酚的90%和干重的18%左右。在蘋果屬以外的植物中,根皮苷均沒有如此之大的積累量,根皮苷的積累是蘋果在植物界中獨(dú)一無二的特性之一。然而,目前蘋果根皮苷的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究利用蘋果種質(zhì)資源二氫查耳酮的多樣性(含量和種類),鑒定出蘋果體內(nèi)催化根皮素合成根皮苷的關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶P2'GT(UDP-glucose:phloretin2'-O-glucosyltransferase),MdUGT88F1。通過改變蘋果MdUGT88F1基因的表達(dá)水平,獲得了根皮苷含量發(fā)生改變的轉(zhuǎn)基因蘋果植株。隨后利用轉(zhuǎn)基因植株和根皮苷含量差異的蘋果種質(zhì)資源,初步解析了根皮苷在蘋果生長發(fā)育和逆境脅迫中的功能和相關(guān)作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.采用HPLC系統(tǒng)分析了411份蘋果種質(zhì)成熟葉片中的二氫查爾酮組成和含量。根皮苷作為蘋果屬植物中最主要的二氫查爾酮,其含量呈典型正態(tài)分布,表現(xiàn)出數(shù)量性狀積累特征。蘋果二氫查爾酮糖苷的組成(根皮苷、三葉苷和三羥基三葉苷)可能主要取決于P2'GT和P4'GT(UDP-glucose:phloretin 4'-O-glucosyltransferase)活性。通過對UGT(UDP-dependent glycosyltransferase)基因表達(dá)水平和根皮苷含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,鑒定出一個(gè)關(guān)鍵P2'GT基因UGT88F1,其表達(dá)水平直接決定了蘋果屬植物的根皮苷含量。蘋果UGT88F亞家族分析和體外蛋白催化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MdUGT88F1的旁系同源蛋白MdUGT88F4,也參與催化根皮素合成根皮苷。2.亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)MdUGT88F1和MdUGT88F4均定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。在蘋果葉片生長發(fā)育過程中,MdUGT88F1(和MdUGT88F4)能通過轉(zhuǎn)錄反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,維持根皮苷生物合成的相對穩(wěn)定。當(dāng)MdUGT88F1(和MdUGT88F4)基因被RNAi(RNA interference)干擾后,轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)根皮苷含量大幅度減少,三葉苷積累,植株生長發(fā)育嚴(yán)重受阻,表現(xiàn)為莖節(jié)間長度變短、葉片細(xì)長、莖分枝變多和側(cè)根減少。研究分析發(fā)現(xiàn),在RNAi干擾植株中,減少的根皮苷,通過調(diào)節(jié)苯丙烷素途徑流通量,間接造成木質(zhì)素合成積累減少;同時(shí),通過間接減少肌醇含量,造成植株細(xì)胞壁果膠組成發(fā)生變化,最終植株表現(xiàn)細(xì)胞壁沉積(cell wall deposition)受干擾,生長發(fā)育受阻。3.MdUGT88F1介導(dǎo)的根皮苷生物合成負(fù)調(diào)控蘋果腐爛病抗性。接種蘋果腐爛病菌Valsa mali后,與GL-3(未轉(zhuǎn)化的蘋果植株)相比,MdUGT88F1過表達(dá)蘋果植株中過量的根皮苷直接被V.mali利用,用于促進(jìn)病原菌的生長和毒素產(chǎn)生,導(dǎo)致植株抗病能力稍微減弱;而在RNAi干擾植株中,根皮苷含量減少不僅能直接限制病原菌生長和毒素產(chǎn)生,而且還能通過間接干擾細(xì)胞壁沉積,介導(dǎo)SA和ROS積累。同時(shí),組織緊密性加強(qiáng)和大量積累的SA與ROS直接限制了V.mali的侵染,最終干擾植株表現(xiàn)為生長發(fā)育受抑制,抗病能力增強(qiáng)。4.MdUGT88F1介導(dǎo)的根皮苷生物合成與蘋果的強(qiáng)光耐受性密切相關(guān)。自然條件下,MdUGT88F1過表達(dá)蘋果植株體內(nèi)過量的根皮苷導(dǎo)致植物氮代謝紊亂,致使氮素虧缺和葉綠素減少,植株最終表現(xiàn)出對自然強(qiáng)光(或UV輻射)脅迫敏感。相反,RNAi干擾植株中根皮苷含量減少,相應(yīng)地促進(jìn)了氮素積累和再利用。這些結(jié)果表明,在自然強(qiáng)光脅迫下,蘋果植株可能通過降低根皮苷的生物合成,改善植株體內(nèi)的氮素代謝,轉(zhuǎn)而提高植株對強(qiáng)光的耐受力。
【圖文】：

二氫查耳酮在植物界的分布(數(shù)字代表每個(gè)植物目中有二氫查耳酮積累的物種數(shù)) (R2016)Fig. 1-1 Distribution of DHCs in botanical orders (number of species containingDHCs per order).單子葉植物中，，二氫查爾酮主要分布在澤瀉目(Alismatales)、天門ragales)、薯蕷目(Dioscoreales)、百合目(Liliales)和棕櫚目(Arecales)。例如的龍血樹(Dracaena)能合成羥基化和甲氧基化的二氫查爾酮分子(Yong Su et al. 2014)；薯蕷目中的 Tacca 能積累具有細(xì)胞毒性的二氫查爾酮分ihydrochalcones (Peng et al. 2010)。另外，姜科(Zingiberaceae)的多個(gè)屬也能耳酮，例如 Etlingera littoralis 中的異戊二烯化二氫查爾酮，etlinglire 2016)。雙子葉植物中，二氫查爾酮?jiǎng)t集中分布在豆目(Fabales)和薔薇目(Rosale(Fabaceae)類植物均能積累簡易二氫查爾酮分子、異戊二烯化二氫查爾酮

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文合成積累顯著關(guān)聯(lián)。另外，三羥基三葉苷的積累對三葉苷存在依賴性。因?yàn)椋谔O果野生種質(zhì)資源或者雜交后代中，均未發(fā)現(xiàn)三羥基三葉苷能獨(dú)立于三葉苷存在(DugédeBernonville et al. 2011; Zhou et al. 2017; Gutierrez et al. 2018ab) (圖 1-2 b)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S661.1

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