【摘要】：果實(shí)品質(zhì)隨著柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和消費(fèi)水平的提高已備受關(guān)注,糖分含量是影響果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。MYB轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最為龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,廣泛參與了植物次生代謝的調(diào)控、激素與逆境脅迫的應(yīng)答以及細(xì)胞模式建成的調(diào)控等眾多生物學(xué)過程,而目前MYB轉(zhuǎn)錄因子影響植物糖代謝的研究則相對較少。本研究以從甜橙中克隆得到的一個(gè)可能響應(yīng)糖信號抑制蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)的MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMYB8作為候選基因,以CsMYB8基因超量表達(dá)番茄株系為主要研究材料,結(jié)合代謝水平與轉(zhuǎn)錄水平的綜合分析對候選基因功能進(jìn)行初探,以期為柑橘果實(shí)品質(zhì)改良及新品種的培育提供重要的候選基因。主要研究結(jié)果如下:1.CsMYB8基因進(jìn)化分析及基因表達(dá)分析表明,CsMYB8與已經(jīng)報(bào)道的可能與蔗糖響應(yīng)相關(guān)的MdMYB6、VvREBP具有較近的親緣性。拷貝數(shù)分析表明CsMYB8基因在甜橙中為雙拷貝。基因表達(dá)分析表明,花后50-60天時(shí)CsMYB8在‘紅暗柳’甜橙中的表達(dá)量明顯低于‘暗柳’甜橙;CsMYB8基因表達(dá)受乙烯誘導(dǎo),但不受糖信號誘導(dǎo);在UV-B處理?xiàng)l件下CsMYB8基因的表達(dá)受到了明顯的抑制,在高溫與低溫的逆境條件下CsMYB8基因均存在不同程度的響應(yīng)。2.亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄活性分析表明,CsMYB8在擬南芥原生質(zhì)體和洋蔥表皮細(xì)胞均特異性地定位于細(xì)胞核中。煙草雙熒光素酶系統(tǒng)分析顯示CsMYB8可能具有轉(zhuǎn)錄激活活性。3.CsMYB8重組蛋白的誘導(dǎo)與純化。通過原核表達(dá)與分離純化獲得純度較高的CsMYB8重組蛋白,為后續(xù)EMSA等相關(guān)生化實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。4.CsMYB8基因超量表達(dá)番茄植株莖頂端出現(xiàn)絨毛增多的現(xiàn)象,掃描電鏡觀察表明植株莖頂端絨毛結(jié)構(gòu)無明顯差異,轉(zhuǎn)基因番茄植株均能正常開花結(jié)果,且果實(shí)在色澤、形狀以及成熟期等方面沒有明顯差異,果實(shí)硬度、果實(shí)Vc含量以及乙烯釋放量均無顯著差異。5.CsMYB8超量表達(dá)番茄初生代謝物質(zhì)測定與分析表明,轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中包括蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖等主要二糖、單糖的含量顯著降低,經(jīng)測定淀粉的含量卻顯著升高。糖代謝途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)分析結(jié)果顯示磷酸戊糖途徑與卡爾文循環(huán)途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因Rpi基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因系中顯著降低。6.CsMYB8超量表達(dá)番茄次生代謝物質(zhì)測定與分析表明,轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中咖啡酸、咖啡酰丁二胺、3-咖啡�？鼘幩岬任镔|(zhì)的含量顯著降低,而柚皮素查爾酮的含量則顯著升高。7.CsMYB8超量表達(dá)番茄揮發(fā)性物質(zhì)測定與分析表明,酯類生物合成的關(guān)鍵酶基因AAT在轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中的表達(dá)量顯著降低,但轉(zhuǎn)基因番茄與野生型番茄果實(shí)檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)含量無顯著性差異。
【圖文】：

圖 1 CsMYB8 與其他物種中 REBP 的蛋白序列比對Fig. 1 Protein alignment of CsMYB8 and other sucrose responsive elementbinding proteins為了進(jìn)一步分析 CsMYB8 和其它 MYB 轉(zhuǎn)錄因子間的進(jìn)化關(guān)系，我們將CsMYB8 與已報(bào)道的 6 個(gè) MYB 進(jìn)行同源進(jìn)化比對，構(gòu)建同源進(jìn)化樹（圖 2）

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017 屆碩士研究生學(xué)位論文3. 結(jié)果與分析3.1 CsMYB8 基因序列及進(jìn)化分析CsMYB8 的 Gene bank 登錄號為 EF537874，CsMYB8 的 cDNA 包括 954bp 開放閱讀框，編碼一個(gè)由 317 個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄蛋白。將 CsMYB8 cDNA 的氨基酸序列與其他植物中已報(bào)到的 MYB 家族蛋白對比，，結(jié)果如圖 1 所示，CsMYB8蛋白包含高度保守的 R2R3 MYB重復(fù)序列，其氨基酸序列全長與蘋果 MdMYB6、葡萄 VvSREBP 分別有 62%、59%的一致性。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S666

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