【摘要】：硫是植物生命活動(dòng)所需的大量營(yíng)養(yǎng)素之一,是植物體內(nèi)半胱氨酸(Cysteine,Cys)、H_2S、輔酶因子等重要含硫物質(zhì)的組成部分。植物通過(guò)根部吸收的SO_4~(2-)被硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的質(zhì)子/硫酸鹽共轉(zhuǎn)運(yùn),隨后被運(yùn)輸?shù)街参镔|(zhì)體及葉綠體中,進(jìn)行SO_4~(2-)的活化及同化途徑。在硫酸鹽同化途徑中,腺苷5'-磷酰硫酸還原酶(Adenosine 5’-phosphosulfate reductase,APR)將活化后的APS還原為SO_3~(2-),SO_3~(2-)再被一系列的酶還原為Cys。目前研究表明APR為硫同化通路中的關(guān)鍵限速酶,高度控制著硫通量,但其在植物硫代謝中的具體功能及作用機(jī)制尚不清楚,因此,本研究通過(guò)對(duì)不同植物物種中APR家族成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以番茄為試驗(yàn)材料,利用病毒誘導(dǎo)基因沉默表達(dá)系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),同時(shí)采用同源重組技術(shù)構(gòu)建APR超表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄植株,研究APR基因在番茄硫代謝通路中的功能及作用機(jī)制,主要的研究結(jié)果如下:通過(guò)生物信息學(xué)鑒定包含番茄在內(nèi)的50個(gè)已測(cè)序植物物種,共122個(gè)APR基因,其中番茄APR基因家族共3個(gè)成員(APR1、APR2、APR3),通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹、motif及內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),番茄APR與馬鈴薯、甘薯、胡蘿卜、多角螺旋藻、大葉藻這5種植物同源性較高;通過(guò)分析番茄與這5種植物的啟動(dòng)子作用元件,發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列均含有SURECOREATSULTR11,這是一個(gè)重要的調(diào)控硫轉(zhuǎn)運(yùn)的順式作用元件;雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果表明,硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sultr2可以結(jié)合在APR上游SURECOREATSULTR11啟動(dòng)子元件上來(lái)激活A(yù)PR的表達(dá)。以Micro-tom番茄為材料,在缺硫脅迫處理下,發(fā)現(xiàn)APR1和APR3 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào);進(jìn)一步對(duì)APR1和APR3進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析,結(jié)果表明,APR1和APR3在根、莖、葉、花、果實(shí)中均有不同程度表達(dá),其中,在根和葉中的表達(dá)量最高,花和果中的表達(dá)量最低且相差不大,根中APR1、APR3表達(dá)量分別是花(果)的11倍、10倍,葉中APR1、APR3基因表達(dá)量分別是花(果)的7倍、6倍;對(duì)APR1和APR3進(jìn)行番茄果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期RT-qPCR分析的結(jié)果表明,在破色期APR1、APR3表達(dá)量最高,綠熟期表達(dá)量最低,破色期APR1、APR3基因表達(dá)量分別為綠熟期的8.5倍和10倍;為了研究APR1和APR3的亞細(xì)胞定位,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了APR1-GFP和APR3-GFP載體,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化本氏煙草,通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),APR1和APR3蛋白均定位在葉綠體中,結(jié)果表明硫同化途徑主要在葉綠體中發(fā)生;為了初探APR1和APR3基因在硫代謝中的功能,本實(shí)驗(yàn)以Micro-tom番茄為材料,利用基因病毒沉默技術(shù)(VIGS),構(gòu)建了APR1和APR3的病毒沉默載體,通過(guò)篩選鑒定得到APR1和APR3沉默植株,并分析Cysteine(Cys)在沉默植株與對(duì)照植株(TRV)中的表達(dá)情況,結(jié)果表明,APR1和APR3基因的沉默會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)Cys含量的下降,說(shuō)明番茄APR1、APR3基因在硫代謝通路中控制著無(wú)機(jī)硫流向Cys的硫通量。為進(jìn)一步鑒定APR在硫代謝通路中的功能及作用機(jī)制,本研究以Ailsa Craig番茄作為材料,利用CRISPR/Cas9技術(shù),構(gòu)建了APR1和APR3的Cas9載體,同時(shí)利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了番茄APR1和APR3的pBI221載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法侵染番茄葉片,通過(guò)篩選鑒定得到T1代番茄APR1基因編輯植株;對(duì)基因編輯植株中的APR上游基因ATPS、下游基因SiR的表達(dá)量進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,在APR1基因編輯植株中,APR上游ATPS基因表達(dá)顯著上調(diào),且表達(dá)量至少是WT的1.5倍,最高的是WT的4倍,而下游SiR基因表達(dá)量均下調(diào),相較于WT至少下調(diào)了40%,最多的下調(diào)了近80%,結(jié)果表明,硫同化通路中ATPS、SiR基因的表達(dá)受到了APR的調(diào)控;采用吸收阱的方法測(cè)定番茄APR1基因編輯植株中內(nèi)源H_2S含量,結(jié)果表明,番茄APR1基因編輯植株中的H_2S含量比WT植株低了近一半,進(jìn)一步說(shuō)明了番茄APR控制著硫同化通路中的硫通量。同時(shí)為研究APR基因在非生物脅迫中的作用,本實(shí)驗(yàn)以T1代番茄APR1基因編輯植株愈傷組織為材料,通過(guò)硒酸鹽脅迫處理發(fā)現(xiàn),相比于WT植株,番茄APR1基因編輯植株愈傷組織褐化更明顯,表明番茄APR1基因編輯植株對(duì)硒酸鹽更敏感。綜上所述,番茄APR1-GFP和APR3-GFP定位在葉綠體中,表明番茄硫同化過(guò)程主要發(fā)生在葉綠體中;APR基因編輯導(dǎo)致下游基因SiR的下調(diào),進(jìn)一步導(dǎo)致硫代謝通路中H_2S、Cys含量的下降,說(shuō)明APR基因在控制硫通量方面發(fā)揮著重要作用。
【圖文】：

圖 1. 1 植物硫代謝通路Fig 1.1. Sulfur metabolic pathway in plants磷酰硫酸還原酶（APR）研究現(xiàn)狀’-磷酰硫酸還原酶（APR）的結(jié)構(gòu)及蛋白亞細(xì)胞定位研究現(xiàn)狀’-磷酰硫酸還原酶（Adenosine 5’-phosphosulfate reductase, AP路中的限速酶。據(jù)研究報(bào)道，在擬南芥中有 3 個(gè) APR 亞型，其是 APR2[35,45]。通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)域分析，APR 具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，，移結(jié)構(gòu)域（Thioredoxin），另一個(gè)是 APS 還原酶催化中心的氨（PAPS_reductase）。N-末端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成 APR 的活性中心，域硫氧還蛋白將電子從 GSH 轉(zhuǎn)移到 N-末端結(jié)構(gòu)域[37-38]。盡管域的序列與硫氧還蛋白、谷氧還蛋白相比較，與硫氧化蛋白同的活性位點(diǎn)由兩個(gè)鄰位半胱氨酸殘基組成，更像谷氧還蛋白，谷氧還蛋白，因此它具有谷氧還蛋白的功能[39]。APR 發(fā)揮作用驟：首先硫酸鹽從 APS 轉(zhuǎn)移到活性半胱氨酸殘基上，通過(guò) C

合肥工業(yè)大學(xué)專業(yè)碩士研究生學(xué)位論文由進(jìn)化樹結(jié)果圖 2.1 A 可以看出，番茄、馬鈴薯、甘薯、多角螺旋藻、大葉藻和胡蘿卜的 APR 蛋白在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個(gè)分支上，因此番茄 APR 基因家族與馬鈴薯、甘薯、多角螺旋藻、大葉藻和胡蘿卜中 APR 基因同源性最高。通過(guò) MEME 網(wǎng)站鑒定了植物 APR 基因的 10 個(gè)保守基序，各物種之間，相同的基序越多，功能越保守，由圖 2.1 A 可知，番茄和這些植物物種基本上都含有這 10 個(gè)基序，表明 APR 基因功能在整個(gè)植物物種中是十分保守的。
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S641.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳宇;高蕾;曹民杰;向成斌;;植物硫營(yíng)養(yǎng)代謝、調(diào)控與生物學(xué)功能[J];植物學(xué)通報(bào);2007年06期

本文編號(hào)：2655993