【摘要】：硫是植物生命活動所需的大量營養(yǎng)素之一,是植物體內半胱氨酸(Cysteine,Cys)、H_2S、輔酶因子等重要含硫物質的組成部分。植物通過根部吸收的SO_4~(2-)被硫酸鹽轉運蛋白介導的質子/硫酸鹽共轉運,隨后被運輸?shù)街参镔|體及葉綠體中,進行SO_4~(2-)的活化及同化途徑。在硫酸鹽同化途徑中,腺苷5'-磷酰硫酸還原酶(Adenosine 5’-phosphosulfate reductase,APR)將活化后的APS還原為SO_3~(2-),SO_3~(2-)再被一系列的酶還原為Cys。目前研究表明APR為硫同化通路中的關鍵限速酶,高度控制著硫通量,但其在植物硫代謝中的具體功能及作用機制尚不清楚,因此,本研究通過對不同植物物種中APR家族成員進行生物信息學分析,以番茄為試驗材料,利用病毒誘導基因沉默表達系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯技術,同時采用同源重組技術構建APR超表達轉基因番茄植株,研究APR基因在番茄硫代謝通路中的功能及作用機制,主要的研究結果如下:通過生物信息學鑒定包含番茄在內的50個已測序植物物種,共122個APR基因,其中番茄APR基因家族共3個成員(APR1、APR2、APR3),通過系統(tǒng)發(fā)育樹、motif及內含子-外顯子結構分析發(fā)現(xiàn),番茄APR與馬鈴薯、甘薯、胡蘿卜、多角螺旋藻、大葉藻這5種植物同源性較高;通過分析番茄與這5種植物的啟動子作用元件,發(fā)現(xiàn)啟動子序列均含有SURECOREATSULTR11,這是一個重要的調控硫轉運的順式作用元件;雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果表明,硫轉運蛋白Sultr2可以結合在APR上游SURECOREATSULTR11啟動子元件上來激活APR的表達。以Micro-tom番茄為材料,在缺硫脅迫處理下,發(fā)現(xiàn)APR1和APR3 mRNA表達水平顯著上調;進一步對APR1和APR3進行組織特異性表達分析,結果表明,APR1和APR3在根、莖、葉、花、果實中均有不同程度表達,其中,在根和葉中的表達量最高,花和果中的表達量最低且相差不大,根中APR1、APR3表達量分別是花(果)的11倍、10倍,葉中APR1、APR3基因表達量分別是花(果)的7倍、6倍;對APR1和APR3進行番茄果實不同發(fā)育時期RT-qPCR分析的結果表明,在破色期APR1、APR3表達量最高,綠熟期表達量最低,破色期APR1、APR3基因表達量分別為綠熟期的8.5倍和10倍;為了研究APR1和APR3的亞細胞定位,本實驗構建了APR1-GFP和APR3-GFP載體,用農桿菌介導的方法轉化本氏煙草,通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),APR1和APR3蛋白均定位在葉綠體中,結果表明硫同化途徑主要在葉綠體中發(fā)生;為了初探APR1和APR3基因在硫代謝中的功能,本實驗以Micro-tom番茄為材料,利用基因病毒沉默技術(VIGS),構建了APR1和APR3的病毒沉默載體,通過篩選鑒定得到APR1和APR3沉默植株,并分析Cysteine(Cys)在沉默植株與對照植株(TRV)中的表達情況,結果表明,APR1和APR3基因的沉默會導致植物體內Cys含量的下降,說明番茄APR1、APR3基因在硫代謝通路中控制著無機硫流向Cys的硫通量。為進一步鑒定APR在硫代謝通路中的功能及作用機制,本研究以Ailsa Craig番茄作為材料,利用CRISPR/Cas9技術,構建了APR1和APR3的Cas9載體,同時利用同源重組技術構建了番茄APR1和APR3的pBI221載體,利用農桿菌介導的方法侵染番茄葉片,通過篩選鑒定得到T1代番茄APR1基因編輯植株;對基因編輯植株中的APR上游基因ATPS、下游基因SiR的表達量進行了分析,結果顯示,在APR1基因編輯植株中,APR上游ATPS基因表達顯著上調,且表達量至少是WT的1.5倍,最高的是WT的4倍,而下游SiR基因表達量均下調,相較于WT至少下調了40%,最多的下調了近80%,結果表明,硫同化通路中ATPS、SiR基因的表達受到了APR的調控;采用吸收阱的方法測定番茄APR1基因編輯植株中內源H_2S含量,結果表明,番茄APR1基因編輯植株中的H_2S含量比WT植株低了近一半,進一步說明了番茄APR控制著硫同化通路中的硫通量。同時為研究APR基因在非生物脅迫中的作用,本實驗以T1代番茄APR1基因編輯植株愈傷組織為材料,通過硒酸鹽脅迫處理發(fā)現(xiàn),相比于WT植株,番茄APR1基因編輯植株愈傷組織褐化更明顯,表明番茄APR1基因編輯植株對硒酸鹽更敏感。綜上所述,番茄APR1-GFP和APR3-GFP定位在葉綠體中,表明番茄硫同化過程主要發(fā)生在葉綠體中;APR基因編輯導致下游基因SiR的下調,進一步導致硫代謝通路中H_2S、Cys含量的下降,說明APR基因在控制硫通量方面發(fā)揮著重要作用。
【圖文】：

圖 1. 1 植物硫代謝通路Fig 1.1. Sulfur metabolic pathway in plants磷酰硫酸還原酶（APR）研究現(xiàn)狀’-磷酰硫酸還原酶（APR）的結構及蛋白亞細胞定位研究現(xiàn)狀’-磷酰硫酸還原酶（Adenosine 5’-phosphosulfate reductase, AP路中的限速酶。據(jù)研究報道，在擬南芥中有 3 個 APR 亞型，其是 APR2[35,45]。通過蛋白結構域分析，APR 具有兩個結構域，，移結構域（Thioredoxin），另一個是 APS 還原酶催化中心的氨（PAPS_reductase）。N-末端結構域構成 APR 的活性中心，域硫氧還蛋白將電子從 GSH 轉移到 N-末端結構域[37-38]。盡管域的序列與硫氧還蛋白、谷氧還蛋白相比較，與硫氧化蛋白同的活性位點由兩個鄰位半胱氨酸殘基組成，更像谷氧還蛋白，谷氧還蛋白，因此它具有谷氧還蛋白的功能[39]。APR 發(fā)揮作用驟：首先硫酸鹽從 APS 轉移到活性半胱氨酸殘基上，通過 C

合肥工業(yè)大學專業(yè)碩士研究生學位論文由進化樹結果圖 2.1 A 可以看出，番茄、馬鈴薯、甘薯、多角螺旋藻、大葉藻和胡蘿卜的 APR 蛋白在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上，因此番茄 APR 基因家族與馬鈴薯、甘薯、多角螺旋藻、大葉藻和胡蘿卜中 APR 基因同源性最高。通過 MEME 網(wǎng)站鑒定了植物 APR 基因的 10 個保守基序，各物種之間，相同的基序越多，功能越保守，由圖 2.1 A 可知，番茄和這些植物物種基本上都含有這 10 個基序，表明 APR 基因功能在整個植物物種中是十分保守的。
【學位授予單位】：合肥工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S641.2

【參考文獻】

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1 吳宇;高蕾;曹民杰;向成斌;;植物硫營養(yǎng)代謝、調控與生物學功能[J];植物學通報;2007年06期

本文編號：2655993